Как удалить фосфат кальция из культуры клеток

[Smol]

А культура клеток не сдохнет, если её дистиллятом промывать? Вымываться-то будет всё, осмос аднака.

Можно и не совсем чистым дистиллятом, но с существенно уменьшенным кальцием (заодно уж - и калием, кто их эти клетки знает, вдруг и правда они умеют трансмутировать)... И слегка подкисленным той же лимонной...

[kpars]

kpars, интересно А зачем Вам удалять фосфат, но сохранять клетки? Подразумевается, что после этого они будут как-то по-другому работать?

Да нет, все намного проще. Мы создали первых трансгенных мышей, в которых специфический маркер одонтобластов (клеток, образующих дентин зубов) можно обнаружить с помощью флуоресцентного микроскопа. Но мы хотим определить, какой процент этих клеток находится в культуре. Сейчас мы это определяем путем деления количества этих клеток на общее количество клеток вручную, что очень утомительно. Мы бы хотели использовать FACS анализ, но для этого клетки должны быть разделены друг от друга, что в минерализованный культуре сделать практически невозможно. Если нет минерализации, то коллагеназа и трипсин без проблем клетки разделяют, но на минерализованный коллаген они не действуют

[kpars]

А культура клеток не сдохнет, если её дистиллятом промывать? Вымываться-то будет всё, осмос аднака.

Можно и не совсем чистым дистиллятом, но с существенно уменьшенным кальцием (заодно уж - и калием, кто их эти клетки знает, вдруг и правда они умеют трансмутировать)... И слегка подкисленным той же лимонной...

Ребята, спасибо всем большое за советы! Скажите еще, пожалуйста, а если не кислотой, то можно ли растворить фосфат кальция щелочью? Может быть щелочная среду будет менее губительна для клеток? Или это совсем глупая идея?

[Smol]

Если щелочью - то только очень сильной (как известно, человека можно в крепкой щелочи растворить целиком, а вот в крепкой кислоте целиком не получится - кости останутся ).
Действие слабой кислоты основано на переводе фосфатов в более растворимые гидрофосфаты (см. http://ru.wikipedia.org/wiki/%D4%EE%F1% ... C%F6%E8%FF ), на этом же основано использование фосфорита как удобрения для КИСЛЫХ почв (в природе это делает вообще угольная кислота, то есть очень слабая газировка ).

Кстати, вот еще хорошая книга, где есть информация по свойствам фосфата кальция: http://www.bibliofond.ru/view.aspx?id=484608

Возможно, наиболее важным свойством ортофосфатов кальция является их растворимость в водных средах, от которой зависит их поведение in vivo в организме человека. Согласно изотермам растворимости, приведенным на рис. 5, при значении рН = 7, соответствующие физиологическим условиям, растворимость ортофосфатов снижается в следующем порядке: МКФМ > a-ТКФ > ТеКФ > ДКФД > ДКФ > ОКФ > b-ТКФ > ГА. В процессе взаимодействия ортофосфатов с водной средой могут происходить фазовые превращения, например гидролиз a-ТКФ с образованием ОГА, сопровождающиеся изменением растворимости. Если реакция происходит преимущественно на поверхности, то такая композиционная система (a-ТКФ в центре и ОГА на поверхности) будет иметь растворимость меньшую, или исходного материала.

Ну, и то, что кислота разрушает у человека зубы - все стоматологи знают.

[avor]

Да сдохнут клетки от уксусу, к бабке не ходи, они уже при 6 дохнут. Как раз только что читал, что самый крутой комплексообразователь кальция ДОТА, но это дорогой и редкий реагент.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/pro ... rich/86734

Лично я вижу только один вариант. Вы добавляете хелатор(можно и все тот же ЭДТА(он же Версен)) и коллагеназу в систему и трясете ее на шейкере. Все что вытрясите - все ваше. Время тряски нужно подбирать, потому что клеткам от всех этих процедур будет нехорошо и среда должна быть без кальция и обедненная сывороткой, а то и вообще без нее. Если это ЭДТА можно наоборот поднять рН, но опять 8 уже критично. Хелаторов их много самый дешевый и доступный, который для кальция неуловимо, но получше будет это ЭГТА.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e4378
Следующим по силе связывания Са будет DCTA
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/34588

[avor]

Да нет, все намного проще. Мы создали первых трансгенных мышей, в которых специфический маркер одонтобластов (клеток, образующих дентин зубов) можно обнаружить с помощью флуоресцентного микроскопа. Но мы хотим определить, какой процент этих клеток находится в культуре. Сейчас мы это определяем путем деления количества этих клеток на общее количество клеток вручную, что очень утомительно.

А зачем вручную можно софтину купить, которая светящиеся и не светящиеся клетки на флуимидже считает.

[kpars]

Да нет, все намного проще. Мы создали первых трансгенных мышей, в которых специфический маркер одонтобластов (клеток, образующих дентин зубов) можно обнаружить с помощью флуоресцентного микроскопа. Но мы хотим определить, какой процент этих клеток находится в культуре. Сейчас мы это определяем путем деления количества этих клеток на общее количество клеток вручную, что очень утомительно.

А зачем вручную можно софтину купить, которая светящиеся и не светящиеся клетки на флуимидже считает.

Можете, пожалуйста, дать ссылку на такой софт?

[avor]

В дистилляте клетки дохнут(лопаются) в течении десятков секунд. А то что среда для отмывки должна быть 1) Без фосфатов и кальция. 2) изотоническая Это и ежу понятно.

[avor]

Можете, пожалуйста, дать ссылку на такой софт?

Могу дать координаты фирмы разработчика, но не сейчас надо визитку поискать.

[grep]

Кальций и цинк необходимы для работы коллагеназы. Если комплексообразователь на несколько порядков лучше связывает цинк, чем кальций, как ЭДТА, то он совершенно не подходит. Использование лимонной кислоты - хорошая идея, на мой взгляд. Вам действительно стоит уточнить константы связывания этих двух металлов с органическими кислотами: цитрат, сукцинат, малат, салицилат и др. И, думаю, кислоты не должны содержать аминогрупп (у цинка к азоту довольно большое сродство)

[avor]

Да!Слона то я и не приметил, коллагеназа требует двухвалентных ионов, а хеллаторы их убивают. Но тогда просто надо поменять схему промывки. Сначала надо пытаться растворить фосфат кальция без коллагеназы, а потом промыться от хеллатора и коллагеназить уже без хеллатора и так несколько циклов а клеточки из промывок собирать.

[amik]

Пока биохимики не перестанут молиться на ЭДТА...

[avor]

Пока биохимики не перестанут молиться на ЭДТА...

Кстати вот вам вопрос от биохимиков: Какой хелатор использовать, что бы магний не связывать, а кальций связывать. рН как водится у биохимиков - 7.

[amik]

Честно - не знаю
Комплексообразователи очень разные и их использование в системах, затрагивающих биохимические процессы непредсказуемо. С точки зрения классического расчета химических равновесий для многокомпонентных систем ион-лиганд достаточно табличных значений констант нестойкости комплексов, рН и ионной силы раствора. На практике, подозреваю, все намного серьезнее и сложнее.
У нас ходила по рукам давным-давно опубликованная таблица условных констант нестойкости комплексов металлов с ЭДТА в зависимости от кислотности среды. У того же кальция при рН 5-6 величина К_нест в районе 2-х(вместо табличной десятки) т.е. можно считать, что кальций практически не комплексуется в слабокислой среде, о чем уже устал повторять. Знаменитый трилон работает в данном случае не более чем слабокислый буфер с собственным родным рН ~ 5,2.

[alien308]

А может добавлять комплексооброзаватель в культурную жидкость, например лимоннокислый буфер с нужным pH для роста клеток, с целью предотвращения выпадения фосфата.

[amik]

Кстати вот вам вопрос от биохимиков: Какой хелатор использовать, что бы магний не связывать, а кальций связывать. рН как водится у биохимиков - 7.

Пообщался со спецами-комплексонщиками. Есть такая партия Используется для прямого титрования кальция в присутствии магния, в частности, были успешные работы для определения Ca в морской воде без предварительного отделения Mg. Как вещество ведет себя в отношении биообъектов(токсичность и т.п.), не знают, но могут синтезировать небольшое количество под заказ, благо исходники почти такие же, как и для некоторых краунов, которые стоят на потоке.
Соотношение констант нестойкости комплексов см. в таблице. Пять порядков разницы это очень и очень весомо!

[avor]

Амик, этот ответ биохимики давно знают.