Вариации состава подвижной фазы в хроматографии на НФ

[SIG]

Коллеги, отчасти навеяно постом уважаемого StYV, отчасти вопросами в лаборатории. Есть некая смесь, которую мы делим препаративно в системе ЭА-Гексан на силикагеле. Точный состав, кроме целевого компонента ( антибиотик-макролид), нам не известен. Теперь возникает вот какой вопрос - какие системы растворителей целесообразно попробовать еще, чтобы поиграться с селективностью. Я понимаю, что вопрос частично абстрактный, частично бессмысленный. Есть всякие номограммы расчета элюирующей силы и прочее. Про такое я знаю. Но здесь меня скорее интересуют примеры из личного опыта. В частности, вроде бы ацетон с гексаном работает лучше. Может быть, у кого-то появятся еще идеи.
И еще вопрос - может быть, кто-то знает что-нибудь о кислом силикагеле. Пока мы готовим его самостоятельно, пропитывая силику раствором гидросульфата натрия и высушивая в шкафу при 280С, но хотелось бы от этого отказаться, так как готовить несколько килограмм уже совсем непросто.

[StYV]

Сила подвижной фазы рассчитывается по простой формуле, если известна сила входящих растворителей и не надо никаких номограмм. Посмотрите материалы фирмы Biotag, если они еще доступны - у меня они тоже где-то есть в электронном виде, да и здесь выкладывались. Там кстати есть рекомендации что на чем делить и что использовать.
Если у Вас есть данные фирмы по этому препарату, то необходимо следовать их рекомендациям - судя по Вашему сообщению Вы примерно представляете что делать. Если надо готовить сорбент килограммами, то придется. Кислый силикагель это экзотика.
Выдавать рекомендации без опыта именно в этом случае смысла не имеет. Вы сами можете попробовать системы исходя из доступности и дешевизны растворителей.
С уважением StYV.

[SIG]

Спасибо ! Посмотрю, что есть, по флэш-хроматографии у меня много материалов. Номограммы есть во многих книжках по ВЭЖХ, в тех же "Растворителях для ВЭЖХ" Рекомендации фирмы у меня нет, есть много патентов довольно бесполезных, так как они, в основном, сводятся к модификации колонки серебром или иными тяжелыми металлами и одна статья 1977 года, по которой работаем. Кроме того, похоже, что у нас профиль примесей несколько иной, чем у тех людей, которые писали патент. Опять же, те сорбенты, на которых они работали, для нас недоступны, фирма, которая их производила, более не существует. Ладно, будем подбирать вслепую, раз никаких более конструктивных идей не возникает.

PS Препаративную ВЭЖХ этой штуки мы практически отработали на С18, теперь в основном сосредоточены на том, чтобы система работала циклически в автоматическом режиме. Геморрой еще тот, но картинки самого прибора я попозже выложу - внушает. Все времен начала перестройки в СССР и от компании Gilson. Большая часть установки собрана из купленного на e-bay или найденного по старым запасам.

[ags72]

Неоднократно в патентах, причем для разных классов соединений,рекомендовали эту систему ЭА-гексан.
Во всех случаях- гораздо лучше работала СНСL3-MEOH.
Но, не с хлористым метиленом.
А,так....

[Cherep]

Так рекомендуют менять компоненты, чтобы тип растворителе йбыл разный
типа сложный эфир супротив простого
хлорорганика супротив алканов

[StYV]

С18 делать все же сложнее (в идеале через литий органику), если можно - лучше поменять на С8. Берете октилбромид и через магнийорганику конденсируете с диметилдихлорсиланом. Конечный продукт не обязательно выделять, ибо эфир и диметилдихлорсилан ,будут отгоняться на роторе.
Материалы по Biotage есть в печатном виде - попробую найти в электронном или могу их дать.
В препаративной хроматографии есть ньюанс, о котором как правило не говорят - это равномерное распределение потока по сечению колонки. При диаметре колонок от 40 мм и выше это чрезвычайно важно. Даже при диаметре 25 мм это видно.
Судя по всему Вы контролируете чистоту препарата по биологической активности, поэтому не совсем важно какую хроматограмму выписывает детектор.
С уважением StYV.

[SIG]

Не, не угадали. Чистоту контролируем исключительно аналитической ВЭЖХ. Препаративная ВЭЖХ идет на стандартной колонке Zorbax C18 21.5 *250 мм 10 микрон. Детектор - препаративный спектрофотометр. Но все это чудо нужно для получения в пределе граммовых количеств очень чистого препарата.

Основная же задача - выйти на деление продукта на прямой фазе, так, чтобы граммы получались за одно разделение. Тут С-18 не поможет - есть одна проблема - этот препарат делится на С18 только при 60 С, даже при 40 пики сливаются. Ну и еще вторая проблема - водно-ацетонитрильный элюент. Воды много, поэтому надо либо реэкстрагировать, либо лиофилизовать. Первое - потери, второе - геморрой, хотя в пределе есть промышленная лиофилка, только она не работает пока.

Так что остается только оптимизировать прямофазное разделение. В принципе, оно практически уже и оптимизированно, просто так нужно две последовательных хроматографии, а хочется одну. Вот и спрашивают младшие товарищи, как с системой растворителей можно поиграться.

[StYV]

Очень давно читал статью по аналитической ВЭЖХ на силикагеле - там очень хвалили систему гексан:изопропанол. Быстро уравновешивается колонка, растворители смешиваются в любых соотношениях и высокая воспроизводимость хроматограмм. Для преп. ВЭЖХ еще важна растворимость продукта в подвижной фазе - ну тут уж как повезет.
С уважением StYV.

[Cherep]

Ну так гексан или гептан с изопропанолом это для ВЭЖХ, блин, варианта
для насосов, для стальной колонный, когда Cv может быть большим и есть детектор

Я как-то делил одну хрень. Так Rf был почти нулевой на ТСХ. На стеклянную колонну наносить побоялся. А на уравновешенной колонке ВЭЖХ (с прямой фазой, разумеется) хорошо выходило. Только в какой минуте при каком расходе -- не помню.

[Vanya Ivanov]

Состав подвижной фазы (для максимального коэф разделения) зависит о хим структуры вашего макролида. Я пользуюсь сейчас хлф-МеОН-NH4OH. У моих полусинтетич. макролидов есть кислотная и основная группа, по этому варьируя кол-вом аммиака (но не ТЭА) можно подобрать на простом СГ вполне себе не плохую селективность в системе хлф-МеОН-NH4OH. Раделение 10-120 мг образца - за два прохода вполне реальная задача. Максимальный результат - 28 мг нового макролида 96% чистоты (вэжх-уф) из 130 мг реакционной смеси после колонки и преп-тсх.
Причем с образцами без кислотных групп (из ионогенных только с диметиламинными) работать существенно проще.
Причем народ в литературе пользует ДХМ и МеОН, а аммиак по обстаятельствам.

[SIG]

Хрень в том, что в этом макролиде есть несколько спиртовых группировок, и одна амидная. И все. Если был какой-нибудь кислотный или аминный фрагмент, можно было бы попробовать ионнообменную смолу. Канамицин какой-нибудь выделять одно удовольствие. А так фиг.

[StYV]

Могу дать упаковку чешского сорбента силикагель-диол для попробовать. Вроде была и такая колонка.
С уважением StYV.

[SIG]

Спасибо большое, но не стоит переводить на меня такой ценный сорбент. Есть ФС, в которой индивидуальные примеси в этой штуке определяют именно на диольной колонке в гексановой ПФ, так что факт деления известен, а в для решения основной задачи мы ничего не получим. Диольный сорбент стоит еще дороже, чем просто С18 или С8. Колонка диольная, кстати, вот-вот должна приехать,начальство таки раскошелилось , тем более, что по методике их надо две по 250 мм.

[Vanya Ivanov]

О! макролиды без ионогенных групп - более стабильны.
а какие количества нужно делить, ну или иметь на выходе? Есть вариант п-тсх, т.е. сыграть на более тонком разделении с потерей совсем небольшого кол-ва целевого соединения.

[ Post made via Windows Smartphone ]

[SIG]

Как бы это сказать помягче. Сначала 5 г, потом больше, больше, еще БОЛЬШЕ В принципе, пока ферментация идет на лабораторных ферментерах, все более-менее понятно. А что мы будем делать, когда запустится полупромышленная установка, я не знаю. То есть в принципе деление у нас получается, и даже масштабируется. Просто коллеги ушли в какую-то с моей точки зрения бесполезную область поверхностной модификации силикагеля тяжелыми металлами ( есть много работ по делению этого соединения на колонках с нитратом серебра), но по-моему это бессмысленно и контрпродуктивно. Хотелось бы их вернуть в лоно продажного силикагеля и обычных растворителей. Ну в крайнем случае какого-то просто модифицированного силикагеля. Но не диола, ни обращенки. Я с трудом представляю, как мы будем набивать даже 10 литровую колонку.

[StYV]

Есть такие системы с аксиальным сжатием и динамическом поджатием, обычно вроде до 10 МПа.
С уважением StYV.

[SIG]

Спасибо, конечно есть. От 60K$ все удовольствие. Даже вроде бы такая колонка есть в институте. Правда,я не уверен, что стеклянная. На ней белки делили, может быть, акриловая.
Я в смысле приготовить 10 л модифицированного силикагеля, а потом еще 10 и еще. Был у меня когда-то опыт - мой первый шеф делал силикагель для Биохиммака. Вся лаборатория была покрыта тонким слоем кремнезема, хотя сушили мы его в вакуумном шкафу с системой конденсации паров.

[StYV]

Делал С8 за раз полкило из ТСХ (Мерк), хорошо промыть метанолом и сушить на воздухе.
Стеклянные колонки диаметром 50 мм (Omnifit) допускают давление не выше 1 МПа, с увеличением диаметра этот показатель должен падать - не знаю насколько. Так что скорее всего надо ориентироваться на металлические колонки.
С уважением StYV.

[A_V_B]

Как бы это сказать помягче. Сначала 5 г, потом больше, больше, еще БОЛЬШЕ В принципе, пока ферментация идет на лабораторных ферментерах, все более-менее понятно. А что мы будем делать, когда запустится полупромышленная установка, я не знаю. То есть в принципе деление у нас получается, и даже масштабируется. Просто коллеги ушли в какую-то с моей точки зрения бесполезную область поверхностной модификации силикагеля тяжелыми металлами ( есть много работ по делению этого соединения на колонках с нитратом серебра), но по-моему это бессмысленно и контрпродуктивно. Хотелось бы их вернуть в лоно продажного силикагеля и обычных растворителей. Ну в крайнем случае какого-то просто модифицированного силикагеля. Но не диола, ни обращенки. Я с трудом представляю, как мы будем набивать даже 10 литровую колонку.

Это, конечно, почти реклама, но "БиоХимМак СТ" делает колонки аксиального сжатия "диаметром 100 мм и высотой 1 метр" и даже хроматографические системы на их основе. По отзывам работающих на такой системе людей она с косяками, но работает. Цену вопроса не знаю.

[SIG]

Знаем про такое - это очень и очень недешево. Тем более. что колонки они делают сами, стоят они сопоставимо с фирменными. Нам такое пока слабо, нам как бы все попроще, в ведре там, или кастрюле какой-нибудь