Вопрос по поводу высаливания белка.

[Pilat]

Я не химик по образованию, просто интересуюсь.

Читал про очистку белка методом высаливания. Суть в том, что экстракт - раствор смеси белков, и каждый из них выпадает в осадок при разном проценте насыщения раствора солью(сернокислым натрием или аммонием), а так же при pH, соответствующей изоэлектрической точке.

Первый вопрос: раз есть изоэлектрическая точка, в который растворимость белка минимальна и он выпадает в осадок, то зачем собственно высаливать что либо?

И второй: А где можно почерпнуть эти сведения? То есть какой конкретный белок при какой насыщении высаливается, ну и изоэлектрическую точку... существует справочник, или база данных?

Буду благодарен за ответы.

[avor]

1) Растворимость белка в изоточке минимальна, но это не означает, что она равна нулю, более того это минимальная концентрация может превышать концентрацию присутствия белка в растворе в десятки, а часто и сотни и тысячи раз.
2) Изоточку можно приблизительно рассчитать по аминокислотному составу белка, но это приблизительно плюс минус пол единицы, а то и единица полторы. Более точно изоточку определяют с помощью специального метода изоэлектрофокусирования(внимание изоточка денатурированного и нативного белка могут сильно отличаться). Данные по изоточкам можно рассчитывать например с помощью онлайн сервисов(swissprot) и баз данных аминокислотных последовательностей(NCBI,EMBL), кроме того изоточки (правда денатурированных белков) можно извлечь из публикаций в журнале Electrophoresis). Что касается данных о насыщющих концентрациях сульфатов(в основном аммония), то эти данные очень скупые и в основном установлены для белков, которые можно получить в больших количествах - миллиграммы и сотни миллиграмм, а таких и сотни не наберется, хотя известны, я думаю, десятки тысяч белков. В основном эти данные рассеяны по статьям, посвященным очистке этих белков. И в небольшом количестве встречаются в обзорах(Methods of Ensymology) и учебниках(Практическая химия белка). Да и кроме того эти данные нельзя считать абсолютными, например зависимость растворимости белка от концентрации соли, кроме рН еще зависит и от присутствия в растворе других белков.

И наконец: метод высаливания белков очень простой, но очень грубый метод очистки белка избирательность метода(коэфициент обогащения) оооочень низкая.

[Pilat]

Благодарю.

[Vanya Ivanov]

Информацию по высаливанию белков из растворов (плазма крови - фракционирование глолулинов/альбуминов) или биомасса - проще всего отслеживать по патентам, там это богато представленно для первичной (грубой) очистки.

[hongma]

Обычно изоэлектрическую точку соблюдают очень приблизительно. Если вообще учитывают. Это актуально только для белков с pI существенно отличной от 6-7, например, пепсина и лизоцима.
Сам метод хорошо работает только если концентрация целевого белка хотя бы порядка 0,1 г/л.
Если литературных данных по высалианию белка нет, проводят предварительный опыт.
Берут концентрации соли от 25-30% (меньше просто не работает) до 100% насыщения с шагом 10-20% и смотрят концентрации
1 минимальную при которой продукт высаливается, скажем, на 10%
2 максимальную, при которойпродукт высаливается на 90%, а в растворе остается достаточно много балласта

Затем в исходную смесь кладут соль до концентрации 1, отделяют осадок (его выбрасывают), кладут еще соль до концентрации 2, отделяют осадок - это очищенный продукт.
Можно повторить очистку высаливанием еще раз, но лучше дальше использовать более селективные методы.