Анализ пептида. L или D?

[Алексей Хрущёв]

Доброго всем времени суток!

Имеется короткий (7 а.о.) пептид с известной последовательностью. Возникло подозрение. что часть аминокислот имеют D-конформацию, а может даже все. Как проверить? Есть поляриметр, но для анализа нужно знать изоэлектрическую точку пептида, можно ли доверять программам считалкам? Вторая проблема в отсутствии методики, может кто направит на путь истинный?

[avor]

Если имеется стандартный образец, у которого заведомо все L, то думаю будет достаточно поляриметра. Не очень понимаю зачем для поляриметрии нужно знать изоточку. Чем короче пептид тем больше можно доверять расчетам pI. В крайнем случае довольно точно изоточку можно определить после расчета. в районе +-0.5 единицы от расчетной, сделав электрофорез с шагом 0.2 единицы в разных буферах. А расчет проверить можно просто, поставив форез в расчетном буфере.

[Алексей Хрущёв]

Увы стандарта нет. Я читал, что в изоточке отклик системы более высокий, следовательно можно взять более низкую концентрацию. Однако видимо придется делать гидролиз, а потом отдавать на аминокислотный анализ, что то все больше склоняюсь к такой мысли...

[avor]

--Увы стандарта нет.
А заказать?
--Однако видимо придется делать гидролиз, а потом отдавать на аминокислотный анализ, что то все больше склоняюсь к такой мысли...
В принципе может помочь хиральная или лигандобменная-хиральная хроматография. Но опять же весьма желателен стандарт.

[Алексей Хрущёв]

Стандарт, конечно можно заказать, но это займет очень много времени, к тому же не даст ответа на вопрос какая аминокислота в пептиде имеет D-конформацию
Хотя можно синтезировать много стандартов с d-аминокислотами во всех возможных положениях
Может есть другие методы?

[avor]

Алексей! Аминокислотный анализ на D-изомеры - это тоже очень не стандартно. Тут тоже понадобится хиральная колонка. И там тоже могут быть подводные камни. Например если есть повторы аминокислот то, что бы установить кто есть кто простой гидролиз не подойдет, а понадобится секвенирование. А пептидный синтез, много где делают. И довольно быстро. Загляните в разделе "работа на заказ". А вот микросеквенирование пептидов это реально не существующая в России услуга.

[Алексей Хрущёв]

Я сам пептидчиком работал, синтез 36 пептидов, займет месяц и будет стоить около 100 тр, если по знакомству, а то и больше...
В пептиде есть два пролина, но я не вижу в этом проблемы просто на хроматограмме площадь пика будет в 2 раза больше чем у стандарта, однако если будет 2 пика - L и D изомеры, конечно придется почесать, пардон, репу, возможно придется делать сиквенирование, в ИБХ вроде раньше сиквенатор был и успешно работал.

[maks]

мысля от непептидщика если позволите
обработать пептид динитрофторбензолом , терминальный пойдет на кольцо там если нужно свой анализ
остальные D and L- аминокислоты на хиральной колонке различите разницу со стандартными L-кислотами
а вообще сочинить синтез такого L-пептида в Китае долларов 150 и неделя работы

[Алексей Хрущёв]

Перечитал 3 раза, но так и не понял зачем метить N-концевую аминокислоту, что это даст?
Все равно же потом сами предлагаете делать гидролиз и анализ на хиральной колонке со стандартами.
Арифметика, 150х36= 5400 дол. или около 130тр, мне знакомые дешевле могут синтезировать, только смысла в этом не вижу никакого.

[avor]

-Я сам пептидчиком работал, синтез 36 пептидов, займет месяц и будет стоить около 100 тр, если по знакомству.
А зачем вам 36(Почему не 128? 2^7=128) пептидов? Вам ведь надо проверить "подозрение не закрались ли D-кислоты" только и надо заказать один пептид "все L". А уж потом разбираться.
Разбираться с тем какая аминокислота и в каком положении - это уже отдельная история отнюдь не дешевая при любом способе. Вы знаете сколько стоит хиральная колонка?

- в ИБХ вроде раньше сиквенатор был и успешно работал.
Гыы! Он микромоли еле тянул. А нужны пикомоли, для белка, с пептидами конечно проще.

-Перечитал 3 раза, но так и не понял зачем метить N-концевую аминокислоту, что это даст?
Аналогично.

[Алексей Хрущёв]

-Я сам пептидчиком работал, синтез 36 пептидов, займет месяц и будет стоить около 100 тр, если по знакомству.
А зачем вам 36(Почему не 128? 2^7=128) пептидов? Вам ведь надо проверить "подозрение не закрались ли D-кислоты" только и надо заказать один пептид "все L". А уж потом разбираться.
Разбираться с тем какая аминокислота и в каком положении - это уже отдельная история отнюдь не дешевая при любом способе. Вы знаете сколько стоит хиральная колонка?

- в ИБХ вроде раньше сиквенатор был и успешно работал.
Гыы! Он микромоли еле тянул. А нужны пикомоли, для белка, с пептидами конечно проще.

-Перечитал 3 раза, но так и не понял зачем метить N-концевую аминокислоту, что это даст?
Аналогично.

Тьфу ты, верно, 128 у самого чтото с арифметикой с самого утра плоховато
Хиральную колонку покупать не зачем, можно за денюжку и обладателей проанализировать.
И все же мне кажется, что начинать нужно с гидролиза и последующего анализа, так можно получить максимум информации в сжатые сроки. Только где взять людей которые этим займутся, у нас к сожалению лаборатория не приспособлена под такой анализ
Если уж синтезировать стандарт, то проверять его идентичность образцу лучше не совместным элюированием на хиральной колонке, а на поляриметре, дешево и со вкусом! Вы писали об этом во втором сообщении.

[avor]

--Если уж синтезировать стандарт, то проверять его идентичность образцу лучше не совместным элюированием на хиральной колонке, а на поляриметре, дешево и со вкусом! Вы писали об этом во втором сообщении.
Дык, я от поляриметрии не призываю отказываться, и на хроматографии не настаиваю.

--Только где взять людей которые этим займутся, у нас к сожалению лаборатория не приспособлена под такой анализ.
А че там если пептида много. То на аминокислотный анализатор его (вроде есть такой сервис? Где конкретно, правда, не знаю), а там по фракциям поделить и каждую фракцию на поляриметр.

[Upstream]

Боюсь, Алексей, что умельцев по части хирального аминокислотного анализа в России найти будет трудно. Попробуйте законтачить с человеком по фамилии Гуранда на химфаке МГУ (ин-т Белозёрского). Несколько лет назад у них этим занимались.
Ещё можно окучитьь пептид подходящим ферментом (папаином) и смесь отдать на МАЛДИ. Связи с участием аминогруппы Д-аминокислот будут жить долго.

[Алексей Хрущёв]

--Если уж синтезировать стандарт, то проверять его идентичность образцу лучше не совместным элюированием на хиральной колонке, а на поляриметре, дешево и со вкусом! Вы писали об этом во втором сообщении.
Дык, я от поляриметрии не призываю отказываться, и на хроматографии не настаиваю.

--Только где взять людей которые этим займутся, у нас к сожалению лаборатория не приспособлена под такой анализ.
А че там если пептида много. То на аминокислотный анализатор его (вроде есть такой сервис? Где конкретно, правда, не знаю), а там по фракциям поделить и каждую фракцию на поляриметр.

Вот хотелось бы найти лабораторию где за это возьмутся, да пока глухо... А ведь на оплату не поскупимся.

[Алексей Хрущёв]

Боюсь, Алексей, что умельцев по части хирального аминокислотного анализа в России найти будет трудно. Попробуйте законтачить с человеком по фамилии Гуранда на химфаке МГУ (ин-т Белозёрского). Несколько лет назад у них этим занимались.
Ещё можно окучитьь пептид подходящим ферментом (папаином) и смесь отдать на МАЛДИ. Связи с участием аминогруппы Д-аминокислот будут жить долго.

Спасибо, за наводку, а в какой он лаборатории работает не знаете?
Насчет протеолиза уже думал, но нужны стандарты L-аминокислот, коих не имеется

[Upstream]

На самом деле я имел в виду завлаба Проф. Швядаса Витаса – Факультет биоинженерии и биоинформатики, отдел биокинетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, корпус Б к.622, тел. (495)939-2355 лаб. Несколько лет назад я рецензировал их статью, в которой они самостоятельно анализировали энантиомерный состав аминоспиртов.
На самом деле для локализации Д-аминокислот в полипептидной цепи известного аминокислотного состава методами протеомики стандарты не нужны. Нужна по возможности наиболее всеядная протеаза, не брезгующая даже связями Xaa-Pro. Ставите протеолиз на микро уровне и наблюдаете динамику молекулярных масс объедков. По двум -трём точкам станет ясно, с кем соседствуют Д-ак-ты. Вряд-ли в природном пептиде их будет больше половины: природа-мать этот ресурс использует очень экономно. Вы должны отчётливо засечь накопление дипептидов вида H-Xaa₁-D-Xaa₂-OH.
Конечно, первым делом следует установить сиквенс в режиме MS-MS на интактном пептиде (одного мкг - выше крыши).

[Алексей Хрущёв]

Интересно. А какую протеазу взять, может смесь папаина, трипсина и химотрипсина?

[avor]

ага щелочную для стирального порошка, Проназу протеиназу К. Я на самом деле не разделяю уверенности в их специфичности к d,l -изомерам. Почитать надо на эту тему.

[maks]

А ведь на оплату не поскупимся

так чего же дешевле 6-7 L-аминокислот

[Алексей Хрущёв]

Времени нет, пока доставят реактивы, пока условия подберем много воды утечет, а нужно побыстрее, как обычно.