Ошибка в синтезе пептидов

[matroskin]

2) nikkochem

1. Юлия использует не менее чем 5-6 кратные избытки активированных карбоновых кислот.
2. ...и что? Здесь речь идёт о выходе материи, не превышающем 0,1%, а вовсе не выходе целевого пептида.

[matroskin]

2) Marionette

Что-то не сходится в ваших описаниях. Вроде берёте 170мг полимера. А содержание защищённых аминогрупп в нём 0,61ммоль/г, т.е. по молям их 0,104ммоль. А Вы говорите про шкалу 0,6ммоль...Или же это характеризует количества конденсирующих реагентов? А смолы берёте в 5 раз меньше...

Что-то у вас с первой стадией...или же со снятием фмока, или же с посадкой первой аминокислоты.

[Marionette]

matroskin:
0,6ммоль/г относится непосредственно к смоле Ринк (так как я описывала выше). А синтез ведем только по шкале 0,1ммоль. Моя ошибка, видимо в предыдущих постах выразилась не правильно.
Сегодня проверяю действие NMP, вечером напишу что получится.
ДМФА заказываем ящиками с Германии (в ящике четыре 2,5л бутыли).

Спасибо всем за помощь,
Юлия

[horks]

На всякий случай, пептиды такой длины будут давать как минимум двухзарядные мол. ионы. в масс-спектре с m/z в 2 раза меньше MW. NMP тяжело упаривать, DMF куда предпочтительнее. Просто проверьте его на диметиламин перед употреблением. Если что, посушите над ситами, перегоните в вакууме.

[matroskin]

2) horks...

Cинтезировал не один пептид подобной длины...и НИКОГДА не натыкался на двухзарядность...
Синтез твердофазный...причём здесь упаривание?

3) Marionette...неплохо бы было после присоединения первой аминокислоты и отщепления от неё фмока померять её содержание спектрально (хоть УФ-визом)...

[Cherep]

да двухзарядность - это вещь непринципиальная
может наблюдаться, а может и не наблюдаться (особливо если метод ионизации FAB)
Also, недавно видел прибор от Agilent - там оператор почему-то заставлял софт сразу делать deconvoluted спектр - типа софт вычисляет молекулярный ион и рисовал масс-спектр БЕЗ ЗАРЯДОВ!. Хорошо, я это просёк, потомучто рядом сидел, а то бы удивлялся, почему у мееня в молекуле на один протон меньше. Полизарядники при этом на картинке вообще не должны присутсвовать.

[nikkochem]

На MALDI можно увидеть и двухзарядник, но всегда нужно помнить что верояноть его существования много меньше.

[Cherep]

в "молди" меньше, а в электроспрее - как нефиг делать

[matroskin]

nikkochem, Cherep...

Проблема не в спектральных данных...материи нет.

[Marionette]

Извиняюсь за долгую отлучку, только вчера закончила синтез при помощи NMP. И он действует!!!! Правда не очень чистый синтез получается, но это уже исправимо =)
Правда вот саму причину "ошибки" так и не выяснили =(
Использовала след. реагенты: 1M DCC/NMP; 1M HOBt/NMP; 25%piperidine/NMP; DIEA. Кстати, заметила что 25%пиперидин/DMF тоже не очень-то и снимает Фмок. Видимо проблема все-таки в ДМФА?
27 января должен прийти новый ДМФА, тогда буду пробовать заново (со старыми реагентами).

Юлия

[Upstream]

Dear Marionette:
Некстати я выпал из общения на этом подфоруме...

Код: Выделить всё

Правда вот саму причину "ошибки" так и не выяснили =(

Ошибка зарыта в вашем протоколе активации - 100% однозначно! Категорически нельзя грузить на "резин" &copy; реакционную смесь, где есть даже следы живого TBTU (и любого другого xxTU)! А у вас он весь живой - до введения DIEA. Нет никаких сомнений, что он прореагирует с аминогруппой и навсегда превратит её в тетраметилгуанидиновую функцию Me₂N-C(NMe₂)=N-C(H)< Через несколько циклов полноразмерных цепей у вас не останется - одни обрубки. Все, кто отдаёт себе в этом отчёт, всегда берут небольшой недостаток TBTU (95%), чтобы исключить это безобразие на корню.
Итого: вначале Fmoc-AK-OH/DIEA (or NMM)/TBTU (1:1:0.95), 5-10 мин, потом делайте, что угодно.

Сначала в тюбик с АК добавляю 600микрол 1M HOBt/DMF + 1200микрол 0,5M TBTU/DMF. Все это дело хорошенько перемешиваю до полного растворения АК и добавляю к резину. Перемешиваю 10сек резин с добавленной к нему АК и добавляю к ним 200микрол DIEA для активации присоединения.

А успех в этом случае связан не с NMP, а с DCC, который к аминогруппам равнодушен.

1M DCC/NMP; 1M HOBt/NMP;

А нингидриновый тест будет синим и с 0.1% остаточных аминогрупп.

[matroskin]

2) Upstream

1. Забавно...
а я всегда брал эквимолярное с аминокислотой количество ТBTU...и никаких проблем...

2. Вопрос остался без ответа...нафига брать HOBT, если есть TBTU...он и так ничего не рацемизует...и образует достаточно активированне производное в присутствии DIEA...

3. По поводу Нингидрина проверяли (это я относительно положительной реакции на 0,1% свободных аминогрупп)?

Marionette...Может, в синтезаторе DIEA добавляется в реакционную массу за некоторое время до прибавления её к резину? Аааа?

[Marionette]

matroskin: В синтезаторе DIEA вообще не присутствует.

[Upstream]

Наконец я добрался до вопросов коллеги Матроскина и постараюсь расставить некоторое количество точек на i.

1. Забавно...а я всегда брал эквимолярное с аминокислотой количество ТBTU...и никаких проблем...

Если Вы перетряхнёте архив масс-спектров неочищенных пептидов и целенаправленно поищите укороченные пептиды с довеском в 98 Да, пару-тройку таких миноров точно найдёте. Грабли эти были впервые описаны немецкими коллегами ещё в 1992 году , которые убедительно продемонстрировали, что XXTU реагируют с карбоксильной группой и аминогруппой с сопоставимыми скоростями:
Gausepohl, H., Pieles, U., Frank, R.W. Schiffs base analog formation during in situ activation by HBTU and TBTU. In: Peptides, Chemistry and Biology: Proceedings of the 12th American Peptide Symposium (Smith, J.A. & Rivier, J.E., Eds). ESCOM, Leiden 1992. pp. 523-524.
В том же году другими коллегами был предложен разумный предохранительный трюк с использованием 5%-недостатка TBTU, который мы незамедлительно взяли на вооружение:
Reid GE, Simpson RJ. Automated solid-phase peptide synthesis: use of 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate for coupling of tert-butyloxycarbonyl amino acids. Anal.Biochem 1992, 200:301-309. Статью можно скачать по этой ссылке (спасибо eFo!):

Код: Выделить всё

http://www.chemport.ru/forum/download/file.php?id=69488

Смысл этого манёвра с недостатком активатора в следующем. Поставщики производных аминокислот (Fmoc - in the first place) не утруждают себя нормированием таких вещей как окклюдированный при кристаллизации растворитель, а его может быть немало - 0.5-1 моля на моль защищённого производного, например, Boc-Ile-OH*0.5H₂O, Boc-Leu-OH*H₂O, Boc-His(Boc)-OH*CCl₄, Boc-Arg(Tos)-OH*EtOAc, etc. Если это не брать в голову, то вероятность напороться на небольшой избыток XXTU и получить эквивалентное количество оборванных цепей ВЕСЬМА ВЕЛИКА и подстраховка оправдана, особенно в синтезе длинных последовательностей.
Наблюдая за иностранным коллегами на форуме ABRF с конца прошлого тысячелетия , я долго не мог понять, почему на эти грабли наступают с такой удивительной регулярностью? ПОнял, кода разжился PDF-ками свежих книжек по пептидному синтезу. "Спасибо" за этот бардак нужно сказать ново-мэтру Альберисио, страдающему тяжёлой формой звёздной болезни (это когда публикуют под сотню работ в год, но до вычитывания их перед отправкой в печать уже не опускаются. Именно он направил доверчивый народ на гуанидиновые грабли в своей главе по конденсирующим агентам (ещё и заслуженного аксакала Карпино подставил!), которая вышла в популярном томе Methods of Enzymology 1997, v289 aka Solid Phase Peptide Synthesis (Fields,G., Ed.), на странице 125 (прилагаю). В том же году вышло грамотное предостережение от PerSeptive, но оно мало кому доступно (прилагаю). А вот действительно забавно, что народ до сих пор совершенно не стесняется рапортовать о своих хождениях по этим граблям. Одна "продвинутая" американка недавно даже возмущалась неадекватными результатами активации готового Biotin-ONSu с помощью TBTU (или даже HATU)!

2. Вопрос остался без ответа...нафига брать HOBT, если есть TBTU...он и так ничего не рацемизует...и образует достаточно активированне производное в присутствии DIEA...

Просто было показано, что ацилирование активированными эфирами, включая -OBt & -OPFP ускоряется почти на порядок в присутствии внешнего HOBt, а также второй эквивалент существенно уменьшает известные осложнения при активации Boc-Arg(Tos)-OH и незащищённых по амидам Asn & Gln.

3. По поводу Нингидрина проверяли (это я относительно положительной реакции на 0,1% свободных аминогрупп)?

Смотря сколько полимера взять на анализ. Яркой синевы не будет, но в рамках количественного нингидринового анализа по Меррифильду (прилагаю*, спасибо Suprachemister'y) с 5-10 мг смолы Кент и др. различают 99.8 и 99.9%
*

Код: Выделить всё

http://www.chemport.ru/forum/download/file.php?id=52475

[Marionette]

Всем огромное спасибо за ответы и способы решения проблемы.
К сожалению, не было возможности проверить DMF на содержание аминов. Но дело все-таки в нем! На пробу заказали ДМФА для аналитики (до этого использовали обычный ДМФА). В принципе разница у них только в проценте. Аналитический 99,8%, а обычный - 99%. Неужели 0,8 так влияет или в нем больше вероятность (и быстрее) появления аминов. Содержание воды в обоих случаях одиноково.
Upstream, очень интересные факты. К сожалению, в нашей лаборатории основа идет именно из книги Solid Phase Peptide Synthesis (правда более свежего издания).
Юлия

[Любитель_Манниха]

Аналитический 99,8%, а обычный - 99%. Неужели 0,8 так влияет или в нем больше вероятность (и быстрее) появления аминов. Содержание воды в обоих случаях одиноково

Ну, раз анализ ДМФА не сделали, то ХЗ, что там может быть налито. У меня один раз нитроэтан от Fluka содержал ~70% хлороформа

[Marionette]

Сделали анализ ДМФА на ГЖХ и результат ужасающий... - он практически 100% чистый =/
Вот вам и тупик...

[Upstream]

Upstream, очень интересные факты. К сожалению, в нашей лаборатории основа идет именно из книги Solid Phase Peptide Synthesis (правда более свежего издания).
Сделали анализ ДМФА на ГЖХ и результат ужасающий... - он практически 100% чистый =/
Вот вам и тупик...

Юля, Вы зря тратите время на подобные экзерсисы!
Очевидно, я просто не донёс до Вашего сознания в полной мере те факты, которые Вы вежливо назвали "очень интересными"... (Не стесняйтесь переспрашивать и уточнять, в Вашем возрасте это вполне естественно!)
В самом деле, неужели Вы ожидали, что в подозрительном буржуйском ДМФА может оказаться столько диметиламина, что весь активированный эфир у Вас превращался в диметиламид, не дойдя до места назначения? Такое возможно только если Ваш девайс по ошибке подавал в ходе активации раствор пиперидина вместо ДМФА!
Повторяю, вся проблема в Вашем совершенно порочном протоколе активации (откуда вообще он взялся?):

Сначала в тюбик с АК добавляю 600микрол 1M HOBt/DMF + 1200микрол 0,5M TBTU/DMF. Все это дело хорошенько перемешиваю до полного растворения АК и добавляю к резину. Перемешиваю 10 сек резин с добавленной к нему АК и добавляю к ним 200микрол DIEA для активации присоединения.

Именно за эти самые 10 сек у Вас и гибнет большая часть амино групп при встрече со свободным TBTU, причём уже в ходе ПЕРВОЙ конденсации! Чудом увернувшиеся счастливцы попадают под раздачу в ходе последующих тупиковых "конденсаций".

[gugu]

По достаточно обширному опыту общения с TBTU могу сказать, что этот реагент достаточно индифферентен к аминогруппам, и порядок добавления реагентов не играет при его использовании большой роли.

[Marionette]

Upstraem,
Я Вас прекрасно поняла по поводу ТБТУ, однако как Вы выразились, в моем возрасте и со степенью бакалавра совсем не пойдет "учить" или спорить с докторантами, которые все 10-15 лет посвятили жизнь синтезу пептидов.
Второе это то, что с аналитическим ДМФА синтез прекрасно получается и порой даже очень чистый. По поводу 10сек я наверное загнула, перемешиваю кислоту буквально двумя трясками, то есть 2сек.