Анализ смолы Меррифилда на содержание хлора

[Semenych]

В книге Дж.Стюарт,Дж.Янг, Твердофазный синтез пептидов авторы предлагают совокупление смолы меррифилда с ацетатом натрия и далее анализ хлорида натрия перешедшего в раствор методом Фольгарда. У мну есть сия потребность в анализе. Вопрос - как коллеги оценивают методу(см файл) и возможно кто-нибудь уже делал схожие анализы , поделитесь собственным опытом.Попутно интересует уменьшается ли содержание бензильного хлора при хранении смолы Заранее благодарен всем высказавшимся!

[nikkochem]

Когда работали с этим полимером то же возникал подобный вопрос. Обрабатывали третбутиловымэфиром-бетта-аминопропионовой кислоты (правда предполагалось пользоватся третбутиловымэфиром-бетта-диметиламинопропионовой) кислоты и DIPEA. Промывали. (Операции вели в синтезаторе дабы не мучатся с промывками). Сушили. Измельчали. На прессе выставляли толщину 0,1 мм. Пресовали пресом в хрупкую пленку (поверности пресса предварительно обрабатывали для предотвращения прилипания пленки). И прям на зеркале пресса снимали ИК - спектр отражения. Реристрировали интенсивность сигнала C=O. Сигнал сильный + воспроизводимость отличная . После гибели пресса умер и данный метод анализа . Теперь верим надписи на упаковке .

[Semenych]

Чуть позже понял, что видимо можно исп-ть и другой подход. Посадить Boc или Fmoc аминокислоту, а далее либо пикриновый, либо колличественный Кайзер либо УФ метод для Fmoc-Pip аддукта при снятии защиты. Или это извращение?

[nikkochem]

Уф врядли просветит через смолу Меррифилда. Может по флуоресценции диметилнафтиламина? Он из-за пространсвенных затруднений переходит при облучении из возбужденного состояния в основное излучательным переходом. Но вот как это поставить на рельсы количественого анализа смолы?

[Semenych]

Уф для р-ра Fmoc-Pip аддукта при снятии Fmoc-a, а не самой смолы.

[Upstream]

Давным-давно, когда мы активно пользовали смолу Меррифильда, титрование хлорид-иона по Фольгарду работало надёжно. Только в ионную форму переводили нагреванием с пиридином, как Стюарт и прописал в последнем издании своей книги (2-ой файл во вложении). У этой методики перед любым спектрофотометрическим методом - масса преимуществ, особенно для новичков в этой области. Минимум совершенно однозначных и идущих с количественным выходом химических превращений, отсутствие неспецифики и помех, связанных с диффузией/десорбцией. Last, but not least - нет нужды брать навески 2-5 мг. В общем, можно не сомневаться, что Фольгард даст наиболее надёжные цифры. Теоретически, вместо гребли с титрованием, хлорид в растворе можно промерить ион-селективным электродом, если он вдруг окажется доступен.
Элементный анализ на хлор - хорошая альтернатива.

интересует уменьшается ли содержание бензильного хлора при хранении смолы

Если хранить его в тепле и на свету - ответ очевиден. Недавно грузили смолы 20-летней выдержки (в темноте при комнатной) от лучших производителей -Bio-Rad S-X1 (~1.3 meq/g) и PRF (0.7 meq/g) через цезиевые соли Бок-аминокислот. Первая грузиться от силы на 50%, причём добиться от неё загрузки выше 1 ммоль/г и 20 лет назад было невозможно; вторая - на 80-90% (пикринка). И в обоих случаях - до фига остаточного бензилхлорида, как показывает исключительно полезный тест, модификация теста Кайзера с внешней аминокислотой после предварительной исчерпывающей кватернизации пиридином (см. статью Тама во вложении). Хлорид количественно обменивается на анион нингидриновой синьки, которую затем элюируют хлоридом Me₄N⁺ или Et₄N⁺.
Возьмите этот тест на вооружение и вы быстро поймёте, почему Меррифильд отказался от использования смолы имени себя ещё в середине 70-х. Для серьёзных задач продажная смола не годится однозначно. Можно, конечно, брать уроки трёхкомпонентной сополимеризации с хлорметилстиролом у Сержл-а...

[Semenych]

Коллега Upstream спасибо за исчерпывающий ответ. Видимо кватернизация с пиридином веселее чем р-ция с ацетатом. У мну тоже биорадовские старьё и нечто поновее от флюки. Цели не особо серьёзные.Как новичок попробую Фольгарда.

И в обоих случаях - до фига остаточного бензилхлорида, как показывает исключительно полезный тест, модификация теста Кайзера с внешней аминокислотой после предварительной исчерпывающей кватернизации пиридином (см. статью Тама во вложении). Хлорид количественно обменивается на анион нингидриновой синьки, которую затем элюируют хлоридом Me₄N⁺ или Et₄N⁺.
Возьмите этот тест на вооружение и вы быстро поймёте, почему Меррифильд отказался от использования смолы имени себя ещё в середине 70-х.

Я правильно понимаю, что химия процесса аналогична статье Sarin VK, Kent SBH, Tam JP, Merrifield RB: Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by the ninhydrin reaction. Anal.Biochem. 1981, 117:147-157.? И небольшой вопрос по статье, смешанный ионообменник Amberlite MB-3 можно заменить каким-нибудь более доступным аналогом Заранее благодарен.

[Upstream]

Любой Mixed Bed Resin пойдёт, чем чище тем лучше. Мы пользуем Bio-Rad без индикатора (!) Для профилактики замочите в 60% спирте на ночь и отмойте от желтизны.

[Semenych]

Спасибо,будем пробовать!

[Upstream]

Кстати, я вполне уверен, что в исходной статье по количественному нингидриновому тесту (Sarin et al) - опечатка, которую с тех пор не раз тиражировали: смешанным ионообменником пиридиновый раствор следует обрабатывать ДО добавления цианида, а не после. Иначе, вместе со следами аммиака С НЕОБХОДИМОСТЬЮ исчезнут и следы цианида, который необходим как катализатор образования синего хромофора! Правда, это существенно лишь для количественного анализа.

Ещё важный момент: количественный нингидрин заточен под определение остаточных аминогрупп при степенях конверсии за 99%; при попытках мерить загрузки выше 1 ммоль/г нингидрин начинает пробуксовывать, лучше пользоваться пикринкой, а выше 2 и она не справляется. Какие-то проблемы с диффузией, которые мне до конца не понятны.

Ещё полезно завести какой-нибудь хорошо охарактеризованный полимер-стандарт и периодически убеждаться, что метод в Ваших руках работает.

[Semenych]

Согласен насчёт ошибки, если не ошибаюсь она исправлена в новом Гершковиче. А какова чувствительность нингидринового метода мкмоль, 0.1мкмоль или ещё менее аминогрупп на грамм полимера Такой же вопрос и про пикринку.
з.ы. погуглил про смешанные ионообменники, российского аналога не нашёл , да и с иностранными как-то не супер.

[nikkochem]

Дорогой Upstream, насколько я понял с цезиевыми солями на смоле Мерифильда реакция идет наиболее полно. Можно методику Пожалуйста. Правда я в последнее время отошел от пептидного синтеза (но это временно).

[Upstream]

А какова чувствительность ...

BM_149-60.rar [Extracts from Barany&Merrifield-1979 (Peptides v2)]

с цезиевыми солями на смоле Мерифильда реакция идет наиболее полно. Можно методику Пожалуйста.

Stewart_53-63-.rar [Extracts from Sewart & Young - 1984]

[nikkochem]

Большое спасибо Upstream. Уже читаю !!!

[Semenych]

СпасибоUupstream! To nikkochem - в Гершковиче тоже была метода по загрузке смолы с цезиевыми солями.