разделение заряженных полипептидов

[paveldereza]

Здравствуйте,

Нужен совет для неорганика.
Пытаемся пришить к полипептиду люминофор, в котором шесть равноценных аминогрупп (М=~2000 г/моль)
Пока пробовали с различными защищенными аминокислотами. Селективно заместить одну-две не получается.
Получается статистический набор продуктов: незамещенный, моно-, ди и т.д.. На обращенном силикагеле делиться отказываются (только по нему ходит люминофор).

Как еще можно попробовать поделить?
Будут делиться на HPLC моно-, ди- и т.д., если попробовать с длинным полипептидом.

Спасибо

[avor]

-Пытаемся пришить к полипептиду люминофор.
Что за полипептид?

-Пока пробовали с различными защищенными аминокислотами.
Зря, для ваших задач проводить подобные пробные эксперименты практически бессмысленно.

Я так понимаю вы люминофор по карбоксильным группам АК, а точнее полипептида пришивать будете.

1) У полипептида обычно не так много карбоксильных групп кроме С-концевой. В нативных условиях часть из них оказывается стерически недоступна. Те в реальности реакция идет по меньшему число карбокси групп, чем можно было бы думать исходя из АК-последовательности.
2) В реальных условиях пришивки, из-за разницы в мол весах полипептида и люминофора, люминофор получается обычно в 5-50 кратном избытке по отношению к доступным карбоксилам, молярная концентрация полипептида тоже получается низкой.
3) Таким образом вероятность посадки на один люминофор ДВУХ и более полипептидов весьма низка в условиях такой пришивки, но есть довольно высокая вероятность получения двух более молекул люминофора на одну молекулу полипептида.

-Как еще можно попробовать поделить?
Если вам хочется в этом поупражняться, то пожалуйста классический способ - электрофорез на бумаге. Я думаю вам нужно попробовать несколько кислых буферов.
HPLC можно попробовать, но я бы в этом случае ориентировался на что-нибудь ионпарное.

-Будут делиться на HPLC моно-, ди- и т.д., если попробовать с длинным полипептидом.
Думаю плохо. Большие полипепептиды не любят большого давления и органических растворителей.
Избавиться от низкомолекулярных продуктов и не прореагировавших реагентов можно диализом или ультрафильтрацией.
Далее можно поставить ПААГ SDS-Диск-электрофорез (он хорошо разрешает полипептиды по ММ). Если анализ покажет много разнозамещенных и олигомерных продуктов. То олигомеры чистим гель-фильтрацией (сорбент Сефакрил(GE,бывшая Pharmacai))
А вот с разным количеством присоединенного люминофора уже лучше ионообменный сорбент, водный буфер и спец колонка с Суперозой S(сорбент) там давление небольшое. Для них есть специальная система FPLC поставляется GE(бывшая Pharmacai)

[anatoliy]

Пытаемся пришить к полипептиду люминофор, в котором шесть равноценных аминогрупп (М=~2000 г/моль)...

А у меня другой вопрос. Чем вызвано применение такого люминофора? Может надо взять с одной аминогруппой? Или это нано?

[Upstream]

Боюсь, что коллега просто выразился невнятно и у него пептид в 2000 Да с 5 лизинами и N-концом. Коню понятно, что в таком случае люминофор или любую другую модификацию нужно было вводить до полного удаления защитных групп. Если поезд уже ушёл и все функциональные группы обнажены, некоторые шансы выбраться из этой ...ямы всё же есть. Посмотрите статью во вложении, где авторам удалось селективно промодифицировать N-концевую аминогруппу изотиоцианатом.

Если же верна концепция коллеги Avor-a, то всё зависит от природы вашего пептида, и без дополнительной информации советы давать бессмысленно.

[paveldereza]

Спасибо за ответы.

Выбор такого люминофора обусловлен его высоким квантовым выходом. Есть люминофор с шестью NH2 и с шестью COOH. "пришить полипептид" - это конечная цель. Пока пептид отсутствует и планируется использовать простейший пептид с 3-5 АК. Т.е. в итоге хотим получить люминофор, у которого 5 групп NHX или COX и у одной группы есть пептидик. Получаем метку, которую можно попробовать пришить к крупным полипептидам или белкам.
В качестве "пептидика" и пробовали АК.
Вот думаем, что такое взять, чтобы заместить только одну группу у люминофора с хорошим выходом.

Спасибо

[anatoliy]

А стерически все амины люминофора одинаково доступны?

[Upstream]

Вот думаем, что такое взять, чтобы заместить только одну группу у люминофора с хорошим выходом.

Next to impossible! Чудес не бывает, особенно одностадийных.
Если бы ко мне пристали с пистолетом и этой задачей, я бы за-Вос-ировал все шесть аминогрупп и в глубоких минусах бы добавил 1-1.5 экв триметилсилилтрифлата, а моноамин после хроматографии бы уже чисто модифицировал. Хотя и это мне тоже не очень по душе.