проблемы клик-химии

[maks]

Уважаемые коллеги
обратились знакомые биологи , у них проблемма
часто ставится метки на протеины через клик химию , они купили стандарные наборы алкинов за большие деньги, протеины были модифицированы в азиды ,сульфат меди, аскорбат,буфер все как полагается, как говорил Жванецкий 2 часа на пару не идет, конверсия 5%
вроде и наоборот покупали азиды флуоресцентные , а модифицировали в алкины , сульфат меди, аскорбат,буфер
а результы аналогичные
у них даже не протеин особо длинный, а пептид в 150 единиц приблизительно
может быть мысли , знания есть какие, ибо процедура постановки таких меток уже лет 10-15 рутина, но может быть есть подводные камни

[Serty]

Метки не мой профиль , но с реакцией дело имел. Обратил внимание, что она плохо идет при кислых значениях рН. Оно должно быть нейтральным или основным.
Ну и второе, может им стоит проверить соотвествует ли то, что они получили, тому что написано на банке. Всякое бывает

[maks]

насчет проверить реагенты скажу , фирма проверенная, но действительно всякое бывает
а Вы работали с пептидами или делали низкомолекулярные триазолы ? буфер они по какой то стандартной прописи используют
я грешным делом стал думать, что если вдруг там много боковых цепей с аминами, эти амины конкурировать могут с лигандом ?

[Serty]

Низкомолекулярные, причем зачастую азиды или ацетилены делались in situ, отсюда и была закисленность. Про белки/пептиды судить не могу. Если буфер, причем уже проверенный все должно быть нормально.
А как они контролировали посадку азидов на белок? Насчет конкуренции я бы не опасался -зачастую у нас были очень грязные смеси, и аминов там хватало.

[maks]

А как они контролировали посадку азидов на белок

врать не буду, пока не знаю
в пятницу прослушал по телефону этот плач Ярославны , постараюсь разузнать подробности

[Maloy]

если с реагентами и условиями все ок, то нужно варьировать медь, может вторую медь протеины выводят из игры и лучше брать первую или нулевую, тк степень окисления металла влияет на предпочтительность координации с тем или иным лигандом

[maks]

вот я тоже не очень понимаю
все берут медь 2 и восстанавливают и химических статей полно, но катализатором является вроде медь1,
ладно у биологов есть ограничения растворимости медьорганических лигандов вроде в воде
а что значит медь ноль ? и она катализирует ?

[Maloy]

я сам не занимался этой реакцией, но со мной рядом работал человек, который ей занимался и он на новом субстрате подбирал медь, иногда лучше всего работала (или исключительно) медь один (CuI, Cu2Cl2), а иногда Сu(OAc)2.

а что значит медь ноль ? и она катализирует ?

медная пыль, медная бронза бывает работала, но что там конкретно работало не вполне ясно, тк поверхность явно окислена и гидратирована, и предварительно не как не подготавливалась

[AVB]

Уважаемые коллеги
обратились знакомые биологи , у них проблемма
часто ставится метки на протеины через клик химию , они купили стандарные наборы алкинов за большие деньги, протеины были модифицированы в азиды ,сульфат меди, аскорбат,буфер все как полагается, как говорил Жванецкий 2 часа на пару не идет, конверсия 5%
вроде и наоборот покупали азиды флуоресцентные , а модифицировали в алкины , сульфат меди, аскорбат,буфер
а результы аналогичные
у них даже не протеин особо длинный, а пептид в 150 единиц приблизительно
может быть мысли , знания есть какие, ибо процедура постановки таких меток уже лет 10-15 рутина, но может быть есть подводные камни

Вы хорошо деоксигенируете реакционную смесь перед добавкой аскорбата?
Азид и алкин первичные? Какую концентрацию меди используете?

Делал эту реакцию для капризных субстратов, работала прекрасно.

[Serty]

...Вы хорошо деоксигенируете реакционную смесь перед добавкой аскорбата?

А вот про это я вообще забыл, так мы то вообще не дезоксигенировали, а просто брали много больше аскорбата чем меди. А в прописях с белками не факт, что это допустимо.

[maks]

сегодня пообщался с дамой пытающейся делать эту химию
детали таковы :
когда в пептиде есть неприродная аминокислота с тройной связью , то флуоресцеиновый маркер с линкером в пять углеродов к азиду идет более менее ничего , модификация стабильно около 40% и их это более менее устраивает
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/A10266

когда в пептиде есть неприродная аминокислота с азидом , то флуоресцеиновый маркер с очень коротким линкером к тройной связи
там когда 5-10% , когда под 30% ,неконсистентно
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/A10267

среди деталей узнал ,что неприродная аминокислота с азидом на бензольном кольце ,
но самая большая их неприятность , что когда модификации идут в 30-40% в обоих системах альфа-геликсовая структура нарушается
и после сего делать им больше нечего

вот такие новости

если есть мысли
в студию !!!

[Iskander]

Длинный гидрофильный линкер на основе ПЭГ-ов.

[maks]

что бы отодвинуть маркер от пептида ?

[Iskander]

Да. Алекса - сильнозаряженный краситель. Высокая плотность заряда может изменить конформацию белка.
Гидрофобный линкер вполне может сам развернуть пептид, потому - нейтральный, на основе ПЭГ-ов.

По меди.
аскорбат хороший восстановитель металлов при повышенном рН. Если рН-оптимум пептида кислый, то реакция может не пойти из-за отсутствия меди. Можно использовать заранее подготовленную Cu(I).
система сульфогруппы с аминогруппой на алексе вполне может комплексовать медь, выводя её из реакции. С подобным сталкивался на красителях Су, где полиеновая система выносила одновалентную медь и реакция шла только при избытке меди в системе.

[maks]

спасибо, а что такое красители Су ?
а можно линк компаний которые торгуют красителями на основе Пегов?

[Iskander]

Cy - это марка цианиновых красителей.
Немного есть тут http://www.jacksonimmuno.com/technical/f-cy3-5.asp
Можно и в Гугле пробить картинки.

Насчёт компании с ПЭГ-линкерами.
Кое-что есть здесь:
http://primetech.by/en/files/pt_products2012en.pdf
Алексы, правда, нет, но есть другие красители под клик-химию с ПЭГ-линкерами. стр. 26 и 29, например.

Есть и чисто химический вариант. Взять ПЭГ, обработать его гидридом натрия и пропаргилбромидом. Получится диалкиновый ПЭГ. Его прикликнуть к азидной Алексе в условиях большого избытка линкера. Поделить обращённой ВЭЖХ (количества нужны небольшие, если есть ВЭЖХ, то это проще всего)

Использовать как обычно.

[maks]

Спасибо

[Ptizza]

аскорбат,буфер все как полагается, как говорил Жванецкий 2 часа на пару не идет, конверсия 5%

Даже у атца клика Шарплесса в статье в Джаксе вежливо упомянуто что он кликует пока не закончится реакция без упоминания времени. Из нашего опыта тетрапептиды кликуются за 72 часа при комнатной температуре. Я делаю небольшой избыток азида и немного катализатора (аскорбат натрия и сульфат меди пентагидрат) и на след. день добавляю азида и катализатора, также делаю на третий день а потом реакционную смесь на лед и кристаллизация. Мне метод не нравится из-за меди как катализатора. Мне закликованные в-ва нужны для измерения флуоресценции и следы металла там нафик не нужны, потому не в восторге от метода. Биологам медь также может мешать.

[S324]

"следы металла там нафик не нужны"
Н2S продувайте

[maks]

ну да, они флуоресценцию пептида тоже меряют по этому красителю Алексе
два часа на пару это классика из Михал Михалыча , хотя надо поинтересоваться сколько они держат, впрочем она говорила что использует стандартный протокол и 40% ей хорошо