полимер+фермент

[MsKarleon]

Каким образом введение в буферную систему поливинилкапролактама (ПВК) активирует ферменты? в частности, увеличивает активность трипсина на 40-60 процентов. ПВК-обратимоосаждаемый термочувствительный водорастворимый полимер, обратимо выпадает в осадок при нагреве более 32 градусов С. В научных статьях есть данные о том, что ПВК стабилизирует многие ферменты, но каким образом-внятного ответа нет.
Я прочел немало статей и диссертаций по данной проблеме и везде основной упор делают на то, что в среде ПВК трипсин изменяет надмолекулярную структуру более выгодным для взаимодействия с субстратом образом. Но никто не задается вопросом о том, что происходит с субстратом!? В своей работе я использую фермент BAPNA, трипсин гидролизует амидную связь с образованием п-нитроанилина. Теоретически, скорость гидролиза может увеличиваться при дестабилизации данной амидной связи. Может ли ПВК "стягивать" электронную плотность с амидной связи субстрата?

субстрат BAPNA.gif

ПВК.gif

[chemlab]

Ваш субстрат довольно полярный, поэтому в воде (полярная протонная среда) гидратирован, что придает ему некую дополнительную устойчивость. ПВК - полярный полимерный апротонный растворитель, может солюбилизировать в себя субстрат и заместить воду. В результате эта дополнительная "водяная" стабилизация исчезает, что приводит к повышению реакционной способности субстрата. Химикам-органикам хорошо известен этот эффект ускорения реакций в апртонных полярных растворителях типа ДМФА, ДМСО, ГМФТА, ТММ и т.п.

[MsKarleon]

спасибо за объяснение! а можно ли инструментальными методами данное явление посмотреть и подтвердить?

[chemlab]

а можно ли инструментальными методами данное явление посмотреть и подтвердить?

Что значит подтвердить? Вы же в первом сообщении утверждаете, что явление наблюдаете, говоря: "введение в буферную систему поливинилкапролактама (ПВК) активирует ферменты" (т.е. скорость гидролиза субстратов). Или именно Ваш фермент не чувствителен к добавке ПВК?
Инструментально измерить кинетику при разных соотношениях вода/ПВК не проблема, были бы инструменты, чтобы замерять концентрации субстрата и/или продукта. Потом эти данные надо обсчитать программой кинетики (обратная задача, нужно будет изобрести кинетическую модель, если не подойдет уравнение Михаэлиса-Ментен), может поисследовать еще и термодинамику (поделать при разных температурах), после этого материал будет готов к печати м.б. даже в забугорье. Для оснащенной и опытной лаборатории кинетики эта работа на несколько месяцев, ИМХО.

[MsKarleon]

мой научрук настаивает на том, что скорость гидролиза повышена из-за конформационных перестроек фермента, я же полагаю, что в среде ПВК дестабилизируется амидная связь субстрата, а как это инструментально проверить-не знаю. Потому что если это действительно так, я должен научруку это доказать. А может быть здесь имеет место суммарное влияние ПВК и на фермент и на субстарт. В любом случае явление есть, осталось его научно обосновать.

[chemlab]

Химия - наука сугубо экспериментальная, все доказательства делаются только натурно. Никакие измышлизмы доказательством быть не могут, они суть только гипотезы, поэтому ничего вы друг-другу не докажете.

[avor]

я же полагаю, что в среде ПВК дестабилизируется амидная связь субстрата, а как это инструментально проверить-не знаю. Потому что если это действительно так, я должен научруку это доказать.

Дорогой мой, берете ваш субстрат и скажем гидролизуете его при рН 9 просто в воде ну или при рН 4 - скорость понятно маленькая. Добавляете свою ПВК и, если вы правы, то скорость возрастет. Ну в данном сучае подтвердится не механизм, а лишь факт катализа гидролиза самим ПВК.

[MsKarleon]

Обязательно проделаю данные опыты, спасибо. Оптимум активности трипсина при ph=7.8-8.2, я работаю при 8,0. В одной из статей прочел о том, что ПВК "расширяет" диапазон ph для фермента Х (не помню название, но выделяют из хрена), так что очень даже может быть, что и для трипсина диапазон "расширится".

[MsKarleon]

Дорогие друзья! Ищу материалы, а также любую информацию о свойствах поли-N-винилкапролактама и его применении. Может быть кто-то работал с ним? В часности, меня интересует его влияние на биообъекты: белки, ферменты и проч.

[avor]

Да, уж, в предложенном мной эксперименте, главное условие это отсутствие фермента. А рН я предложил сдвинуть, что бы ускорить реакцию гидролиза, при рН 8 она может быть уж очень маленькая.

А фермент из хрена это пероксидаза скорее всего, а то что ПВК расширяет диапазон ее рабочих рН факт в пользу гипотезы шефа, да и механизм реакции, катализируемый пероксидазой имеет мало общего с гидролизом пептидной связи.

[avor]

прям скажем не густо.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entre ... earch=true
http://www.freepatentsonline.com/result ... rch=Search

[Polychemist]

Аналогичная тема появилась в "полимерах". Это очень неправильно. Перенес сюда. Если хотите, могу перенести всё туда. Но больше так не делайте.

[MsKarleon]

я понял, извините. Кроме всего прочего мне интересен сам ПВК, поэтому хотел узнать о нем побольше

[OCULIS, NON MANIBUS]

Интересная тема, жаль только сейчас увидела
Влияние полимера на активность фермента за счет изменения его конформации - это вообще стандартный ответ биотехнологов, биохимиков и иже с ними, то есть с нами Изучить механизм влияния полимера на фермент не так-то и просто. Ведь на основании косвенных методов, типа вискозиметрии и спектрометрии, вообще что-то говорить по этому поводу затруднительно. Опять же биологи привыкли больше искать ответы в самих белках чем в их субстратах поэтому позиция Вашего шефа вполне логична. ПВК действительно хороший стабилизатор ферментов, но вынуждена согласится - литературы по этому его действию не так-то уж и много

[Upstream]

ПВК действительно хороший стабилизатор ферментов, но вынуждена согласится - литературы по этому его действию не так-то уж и много

Зато - уверен - такой литературы полно по сверхпопулярному в биохимии низшему гомологу - поливинилпирролидону. Вряд ли трипсин учует разницу между ПВК и ПВП с близкими по длине цепями.

Сдаётся мне, что сей феномен:

увеличивает активность трипсина на 40-60 процентов

имеет простое и изящное объяснение, если задуматься об интимных подробностях такого широко известного явления как автолиз (см. Google: автолиз трипсина). Трипсин является собственным субстратом и медленно, но верно сам себя расщепляет. Этот молекулярный каннибализм с необходимостью означает, что в растворе молекулы трипсина находятся в равновесии с медленно превращающимися фермент-субстратными комплексами, весьма своеобразными димерами трипсина, в которых одна молекула заингибирована, т.к. вцепилась мёртвой хваткой в другую, а последняя при этом ещё может работать с субстратом, или даже закусить третью молекулу фермента, и т.д. (никогда об этом раньше не задумывался!). В растворе ПВК(ПВП) отдельная молекула трипсина имеет шансы оказаться в стат. клубке линейного полимера и даже образовать с ним супрамолекулярный комплекс. Если эта гипотеза верна, то равновесие постепенно сместится в сторону таких комплексов, которым будет трудно подобраться к себе подобным, но маленький хромогенный субстрат они будут переваривать с прежней эффективностью, причём удельная активность фермента примерно удвоится. Что Вы, собственно, и наблюдаете.

[OCULIS, NON MANIBUS]

Вы знаете, Upstream, то что Вы говорите - это действительно очень интересная мысль. То-есть активность фермента как таковая не растет, но за счет того что фермент "не тратит время" на автолиз, наблюдаемая активность по BAPNA увеличивается? Опять же нет инактивации фермента за счет самогидролиза. Но, правда, это объяснение подходит только для суицидальных ферментов типа трипсина, а вот как быть с пероксидазой? Этот ведь не протеаза и к автолизу понятно не склонна. Но при взаимодействии ее с ПВК наблюдается значительное расширение как рН- так и термопрофиля, термостабильность тоже растет.

[Vanya Ivanov]

Про что собственно исходный вопрос? Изменяет ли ПВК конформацию субстрата или даже саму пептидную связь в субстрате! Можно ли померить хим сдвиг ПМР амидного протона в субстрате с/без ПВК. Вроде сам полимер не закрывает зону 8-13 м.д. Если сигнал амидного протона "уползет" в область слабых полей после добавления ПВК - вот оно и косвенное доказательства влияния полимера на субстарат - вроде все просто ...

[OCULIS, NON MANIBUS]

Интересная идея, подход органической химии. С точки зрения биотехнолога есть более простой вариант: поставить такой же эксперимент с высокомолекулярным субстратом, например казеином или гемоглобином. Если стабилизация сохранится, то дело не в субстрате, а в ферменте.

[Vanya Ivanov]

Если ПВК может действовать и на фермент и на субстрат, то замена субстрата не даст ответа на вопрос - действу ли фермент на субстрат. С точки зрения "философии науки" - свойства компонентов системы нужно изучать вне системы, т.е. свести сложное к простому. Разделить компоненты и изучить. Т.е. исключить фактор "усложнения" который возникает при смешении компонентов в систему.

[Upstream]

Но, правда, это объяснение подходит только для суицидальных ферментов типа трипсина, а вот как быть с пероксидазой? Этот ведь не протеаза и к автолизу понятно не склонна. Но при взаимодействии ее с ПВК наблюдается значительное расширение как рН- так и термопрофиля, термостабильность тоже растет.

В рамках той же гипотезы о супрамолекулярном комплексе это легко объяснить: намотанный на белковую глобулу линейный ПВК играет роль подпруги, или корсета, который поддерживает "фигуру" фермента в рабочем состоянии. Но... Всё это, видите ль, слова, слова, слова. © Продемонстрировать такое - задача трудоёмкая и непростая. Как минимум, нужна зависимость хорошо измеряемого свойства фермента (с протеазами - удельной активности) от концентрации ПВК. Это может выявить образование молекулярных комплексов. И посмотреть динамику изменений свойств фермента во времени при фиксированной концентрации ПВК.
Корсет, ясное дело, выполняет свои функции лишь в застёгнутом состоянии. Применительно к нашим объектам это означает, что цепи ПВК, которые короче, чем "опоясывающая глобулы по экватору", будут работать плохо, или не будут работать вообще. Где найти умельцев, а главное - энтузиастов получать такие олигомеры с узким распределением по мол. весу, надеюсь, подскажут наши эксперты по ВМС.

Лично мне не понятно, что может дать изучение влияния ПВК на ползучий хим сдвиг слабопольного амидного протона субстрата. Это ведь - братская могила всевозможных влияний, из которой, как правило, ничего определённого не вытащишь! Да и какое это может иметь значение, если для ПВК в активном центре место не предусмотрено? Он - что же - заряжает субстрат перед входом в норку, как Алан Чумак?