Методика выделения ДНК из растений.

[tov.ST@LIN]

Кто знает методику выделения ДНК из растений. Из каких тканей лучше и чтоб реактивы не были затратны?
А ещё было бы неплохо методики количественного определения пуринов и пиримидинов.

[Archeolog]

Кто знает методику выделения ДНК из растений. Из каких тканей лучше и чтоб реактивы не были затратны?
А ещё было бы неплохо методики количественного определения пуринов и пиримидинов.

Есть такой справочник биохимика
http://download.nehudlit.ru/nehudlit/self0013/doson.rar
посмотрите, может быть там и найдется что-либо подходящее для Вас.

[Polychemist]

Недавно мне помогли со статьей, может и Вам пригодится:

Aust. Syst. Bot. 6, 139-148.pdf

Ну а вообще-то Вам на molbiol.ru прямая дорога.

[expert]

Кто знает методику выделения ДНК из растений. Из каких тканей лучше и чтоб реактивы не были затратны?
А ещё было бы неплохо методики количественного определения пуринов и пиримидинов.

Советую почаще использовать Google or Yahoo. Например Google поиск "isolation of dna from plants" дает 5260 хитов.
Например одна из первых ссылок http://www.barc.ernet.in/webpages/lette ... 410-32.pdf
Что касается количественного определения пуринов и пиримидинов, то в двухцепочечноий ДНК их в точности равное количество.
А если серьезно, то задача нетривиальная. Компания которая успешно решила проблему общего анализа пуринов и пиримидинов и использует результаты для идентификации микрооганизмов IBIS Biosciences
http://www.ibisbiosciences.com/pages.asp?ID=33
Organism Identification

The Ibis T5000™ Biosensor System is a research use only (RUO) universal biosensor platform designed to identify any biological organism, including bacteria, viruses, fungi, protozoa, and parasites.

Following DNA extraction and PCR amplification, the Ibis T5000 uses mass spectrometry to rapidly determine the precise weights of the nucleic acids present and the corresponding A, C, T, and G content of each amplicon. The Ibis T5000 Biosensor System´s signal processor determines the base compositions of the PCR products and identifies the organisms present.

In the broad microbe identification mode the Ibis T5000 Biosensor System answers the question: "What infectious organism(s) is in my sample?" If a novel organism is found, it is reported as novel accompanied by information about its relation to known organisms

Простым смертным остается секвинирование или тотальный гидролиз нуклеазами с последуюсщим HPLC анализом А,Т, Г и Ц

[StYV]

Действительно, количественное определение пуринов и пиримидинов без ВЭЖХ практически нереально.
С уважением StYV.

[tov.ST@LIN]

Спасибо всем, просто нужно было отследить изменение в массе ДНК у исследуемых организмов, и как можно более точно. Т.е. выделить из клеток организма ДНК и как-то количественно его отобразить! Но всё равно спасибо за источники.

[Vanya Ivanov]

Самый простой и реальный метод:

Химия и жизнь, 2002 № 2 (что-то типа клуб Юный химик)
Выление сумарной ДНК из растений

[tov.ST@LIN]

Да-да там много интересного. Однако, убедительная прозьба: Необходима информация о мотедах выделения ядерной ДНК из сперматогоний и овогоний, а также самих половых продуктов млекопитающих, в частности мышей.
Неплохо бы чтобы эта информация включала также методы измерения длин хромосомных ДНК, или, в крайнем случае, массу каждой молекулы целиком.

[avor]

Необходима информация о мотедах выделения ядерной ДНК из сперматогоний и овогоний, а также самих половых продуктов млекопитающих, в частности мышей.
Неплохо бы чтобы эта информация включала также методы измерения длин хромосомных ДНК, или, в крайнем случае, массу каждой молекулы целиком.

-а также самих половых продуктов млекопитающих, в частности мышей.
Коба! Это вы сперму имеете ввиду. Или что вы называете половыми продуктами?

Выделение ДНК позвоночных , Коба, стандартная процедура. Описана она в мануалах например в книжке Маниатиса Молекулярное клонирование(МИР 1984) состоит из четырех шагов. 1)Экстракция ткани анионным ПАВ 1%SDS 2)Обработка "протеиназой К" 3)Экстракция фенолом сатурированым водой с рН 7-8 остаточных пептидов и денатурированных белков. 4) Осаждение спиртом.

Но! Во-первых такая ДНК содержит РНК, от которой можно избавится РНКазой и опять протеиназа-фенол. Во-вторых такое выделение далеко не является количественным.

ДНК растений выделяется по другому, там используется катионное ПАВ ЦТАБ(CTAB, цетилтриметиламмоний бромид) это ПАВ при определенной ионной силе дает осадок ДНК. Почитать можно в книжке Генетическая инженерия растений МИР 1991. Этот метод для растений предпочтительней ибо лучше очищает от полисахаридов.

Теперь про сперматогонии и овогонии. Дело в том, что у млекопитающих, спермии формируются в огромных количествах и практически на протяжении всей жизни самца(ну мужаки-то знают), а вот яйцеклеток закладывается строго ограниченное количество и в период эмбрионального развития(те во время беременности матери самки), что в принципе является причиной женского климакса(Ну бабы-то знают) женский организм способен только на ограниченное число овуляций, а число этих овуляций ограничено числом, заложеных еще в период эмбриончика овоцитов. Отсюда сразу скажу, что навыделять ДНК из "тестисов" это как "два байта переслать"(тем более ДНК в спермиях чуть ли не 80% по весу), а вот из овоцитов "тот еще геморой".

--Неплохо бы чтобы эта информация включала также методы измерения длин хромосомных ДНК.

Наверное это сильное утверждение, но я скажу так: - На сегодняшний день не существует прямых методов измерения длины хромосомной ДНК, ну, уточним, мне и многим моим коллегам-биологам они не известны.

Далее по теме: Вообще говоря в нормальном и здоровом организме число хромосом (а так же их размер, форма и даже локализация генов в них) и генов считается более или менее постоянной величиной характерной для данного вида. Отсюда мораль: нет ничего нормального, что может привести к изменению размеров хромосомной ДНК и количества ДНК в хромосоме (вот патологические воздействия могут привести к чему угодно любимые термины для таких процессов (мутация, делеция, хромосомная аберрация и тд)) .

Исключением является теломерное укорочение хромосом по мере увеличения числа циклов деления СОМАТИЧЕСКИХ (НЕ ГАМЕТ) клеток.


Так вот измерение длины теломер это вполне отработанная и вполне осуществимая методика и она включает в себя методику выделения ДНК. Но измерение ее количества здесь не причем. Суть метода состоит в том, что теломерную ДНК позвоночных невозможно подвергнуть гидролизу ни одной известной специфичной рестриктазой, а вот вся остальная ДНК ими гидролизуется практически по случайному закону. В итоге если общую ДНК обработать несколькими рестриктазами, то не гидролизованными останутся только теломерные фрагменты. Дальше ДНК разделяют с помощью электрофореза, денатурируют, переносят на полимерную мембрану и гибридизуют с одноцепоченой комплементарной теломерам ДНК, меченной радиоизотопной или химической меткой(такой подход позволяет снизить в тысячи раз фон от случайно гидролизованной ДНК) и определяют длинну теломерных фрагментов по их подвижности в геле.

Должен заметить, что теломеры мыши опять таки являются неудобными для этого метода, в силу своей экзотически колоссальной длины, порядка 100000 нуклеотидных пар(человек порядка 15000)
Для электрофореза такой длинной ДНК нужен специальный пульс-форез и главное на фоне такой длины никакое укорочение на 200-300 пар оснований невозможно заметить, да и 1000 тоже трудно разрешить.

Теперь об измерении количества ДНК. Обычно для ее измерения ДНК из клетки не выделяют и не взвешивают. Обычно для этого клетки окрашивают специальными ДНК красками, которые флуоресцируют в комплексе с ДНК(Пропидий иодид, этидий бромид, Хехст(бензимидин), DAPI см. Pubchem). А затем просто измеряют степень флуоресценции ДНК в клетке. Сделать это можно либо с помощью флуоресцентного микроскопа(крайне редко), либо с помощью проточного цитофлуориметра (практически стандарт). Естественно этот метод не абсолютный, а относительный. Его используют для контроля репликации(удвоения) и деградации ДНК. Если вам удасться скопить и отделить от остальных клеток, клетки находящиеся в митозе(5% в пролиферирующей ткани, 0.01-0.1% в покоющейся ткани), то их можно разрушить из них выпадут хромосомы и их можно будет тоже покрасить и пропустить через цитофлуориметр, который сможет по интенсивности свечения отличить одну хромосому от другой, но не сможет отличить незначительное(теломерное) изменение длины хромосомы, но зато сможет заметить фатальные нарушения типа хромосомных аберраций.
Для контроля изменения длины теломер флуоресцентными методами используют метод гибридизации флуоресцентного зонда(комплементарная теломерной последовательности нить ДНК, ковалентно связанная(коньюгированная) с флуоресцирующей молекулой (например тетраметилродамин)) с теломерой. Это возможно только при наличии отдельных хромосом в деконденсированном хроматине метод практически не работает, флуоресцентный микроскоп или цитофлуориметр(большой вопрос подготовки гибридов для этого прибора)(измерение интенсивности свечения) Однако точность такого метода еще меньше чем электрофоретического, а его главное преимущество это возможность проследить за одной конкретно взятой хромосомой.

Коба! Видите какую я лекцию написал, на досуге так сказать. А ведь вы бы могли все это сами прочитать в книжках, учебниках, статьях. Кстати оно бы и на мозг легло бы тогда лучше. Не форумный ваш вопрос, не форумный.