И снова нужна помощь! методика определения АТФ, АМФ, АДФ.

[Nana]

Помогите бедным украинским диссертантам-медикам! Срочно нужна методика определения АТФ, АМФ, АДФ. Для применения в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных.

Заголовок поправил. amik

[expert]

[Nana]

Спасибо, но колон.хроматошрафии нет. Пытаюсь найти прибор. Зато у нас есть все для билхимических исследований, вот и рыскаю в поисках методики.

[StYV]

Вам нужен жидкостный хроматограф, в качестве колонок лучше использовать анионообменники типа SAX, либо амино- , но первые лучше. Еще будет проблема со стандартами, их придется чистить даже свежие, также потребуются чистые (оптически) соли. Зато увидете весь нуклеотидный пул.
Все это непростая проблема, занимался такой фигней. Лучше найдите кто бы это делал для Вас, или определяйте только АТФ.
С уважением StYV.

[expert]

Вам нужен жидкостный хроматограф, в качестве колонок лучше использовать анионообменники типа SAX, либо амино- , но первые лучше. Еще будет проблема со стандартами, их придется чистить даже свежие, также потребуются чистые (оптически) соли. Зато увидете весь нуклеотидный пул.
Все это непростая проблема, занимался такой фигней. Лучше найдите кто бы это делал для Вас, или определяйте только АТФ.
С уважением StYV.

Действительно, проще всего найти доступ к прибору и купить ионообменную колонку, хотя обращенно-фазовая хроматография тоже используется. Нужны одхако ион-парные реагенты и не все колонки подходят. Но вот интересно Поиск Google дал несколько интересных хитов
http://www.google.com/search?hl=en&q=an ... h&aq=f&oq=

http://www.ital.sp.gov.br/bj/artigos/bj ... 26a334.pdf
The bioluminescence technique has been used for a long time in the measurement of
adenosine triphosphate (ATP). Up to the end of the seventies the assay was complicated and
the results uncertain because of low purity reagents and poorly controlled reaction conditions.
With the introduction of a new type of luciferin-luciferase reagent, the ATP Monitoring Reagent
(AMR), these disadvantages have been overcome and as a consequence, the application of the
assay has been extended. The new reagent results in the emission of light of an almost constant
intensity, proportional to the ATP concentration. This is in contrast to the flash obtained with
conventional reagents. This new technique facilitates measurements and improves the
sensitivity of the assay. The reagent may also be used to monitor changes in ATP concentration
because the ratio between the ATP concentration and light intensity remains constant. This
work describes the principle, the methodology for the determination of ATP, ADP and AMP by
the luciferin-luciferase reaction in fruits like apples, pears and sweet cherries and some
application fields.

[pomogblin]

Прошу дать ссылку на методику анализа АТФ (а также АМФ и АДФ) методом хроматографии (ТСХ).

[expert]

Прошу дать ссылку на методику анализа АТФ (а также АМФ и АДФ) методом хроматографии (ТСХ).

pomogblin,
Конечно, методы древние, но робють як старые молотки. Сделайте поиск в Google с использованием следующих ключевых слов (analysis ATP AMP paper chromatography ammonia butanol).
В частности, я нашел две статьи, которые пришиваю к этому посланию.
Самой методики у меня нет, но её воспроизводили студенты под моим чутким руководством сотни раз. Помню что использовалась бумага Ватман и система содержавшая н-бутанол, аммиак и воду. После прогона хроматографии и высушивания на бумагу накладывали пластину с пластиковой (не алюминиевой!) подложкой для тонкослойной хроматографии содержащей слой силикагеля с UV подсветкой. Сквозь пластину можно было наблюдать в ультрафиолете тёмные пятна компонентов.*** Пятна обводились карандашом, вырезались ножницами и количественно смывались в стандартный объем буфера. Раствор измерялся на спектрофотометре и результат соотношения компонентов сдавался преподавателю. Потом я заменил эту методику на колоночный метод с ион-парной хроматографией с использованием Милихрома. Это было интересней, надежней и быстрее.
***Для проявления также можно использовать опрыскивание, но я уже не помню реагенты, которые не влияют на важные аналитические волны аденина. Не знаю если продаётся бумага с подсветкой. Наверняка продаётся или можно изготовить самому "подпудриванием" бумаги сульфидом цинка до или после хроматографии.

[pomogblin]

Большое спасибо за информацию. Может у вас (на кафедре) осталась методичка по которой вы делали эту лабораторную, если да, то прошу выслать так как состав для элюирования в тех статьях отличается по компонентам от указаного вами. Хочу использовать опробованый вами метод.

[expert]

Большое спасибо за информацию. Может у вас (на кафедре) осталась методичка по которой вы делали эту лабораторную, если да, то прошу выслать так как состав для элюирования в тех статьях отличается по компонентам от указаного вами. Хочу использовать опробованый вами метод.

pomogblin, я знаю, что кафедра осталась - это уже хорошо. Однако методичка - очень сомневаюсь. Не расстариваитесь. Метод надежный и "простит" Вам вариации в больших пределах. Попробуйте со стандартными соединениями. Все-равно Вам нужно систему калибровать.
Ещё я припоминаю, что бумагу после хроматографии высушивали и все же опрыскивали в специальной камере. Я думаю, что это был очень-очень разбавленный флюоресцеин, так что его оптической плотностью по сравнению с АТФ-АДФ-АМФ можно было пренебречь.
Удачи!