Потеря вещества на колонке

[Алексей Хрущёв]

Добрый день, коллеги!
Существует проблема практически необратимой сорбции вещества на фазу С18 во время препаративной хроматографии, как с набивными колонками так и с заводскими Phenomenex 20х250мм и со многими другими. В случае сильно основных соединений - аргинин-богатых пептидов потери иногда составляют 50%, были случаи когда вещество садилось на 100% и вышибали его буферными растворами с рН=6. Особо остро стоит проблема при использовании безбуферных систем - вода-ацетонитрил, или изопропанол. Подвижная фаза обычно, 0,1% уксусная кислота или безбуферная. Встречался ли кто-нибудь с подобной проблемой?

[sav]

Что сказать... Учите матчасть.

[Алексей Хрущёв]

Интересно, а поумней ответы будут?

[chemist]

Аргинил сильно полярный, вряд ли он захочет десорбироваться не сильно полярным элюентом, против природы не порёшь, какие ещё нужны аргументы?

[Алексей Хрущёв]

Ну там кроме аргиника куча всего еще есть. Пептид в целом нормально подходит для обращенки - выходит в 25-30% ацетонитрила, проблема в очень прочном взаимодействии с силанольными группами неподвижной фазы, может есть какой-нибудь модификатор который легко удаляется при упаривании?

[Deminolog]

Сорбент эндкеппирован?
25-30% по объему ацетонитрила - элюент не очень сильный. Если Вас интересует только один компонент - то зачем городить огород?

[Любитель_Манниха]

были случаи когда вещество садилось на 100% и вышибали его буферными растворами с рН=6

Непонятна проблема. pH = 6 и ниже - вещество разваливается? 0.1% трифторуксусной кислоты в элюенте - адЪ и погибель?

[Алексей Хрущёв]

Сорбент эндкеппирован?
25-30% по объему ацетонитрила - элюент не очень сильный. Если Вас интересует только один компонент - то зачем городить огород?

Нужно избавться от близко идущих примесей. Проблема в том что севший на колонку продукт потом ничем не смывается...

[Алексей Хрущёв]

были случаи когда вещество садилось на 100% и вышибали его буферными растворами с рН=6

Непонятна проблема. pH = 6 и ниже - вещество разваливается? 0.1% трифторуксусной кислоты в элюенте - адЪ и погибель?

Я же написал, что обычно используется 0,1% уксусная кислота, рН там около 3, но при этом рН, а еще сильнее в бузбуферной системе вещество садится на колонку, повышение рН снижает в некоторых случаях потери, но не всегда и работать с такими буферами не удобно в случае серьезного препаратива по ряду причин. ТФУ использовать нельзя, поскольку токсична для клеток.
Насколько я знаю все колонки Phenomenex серии Jupiter энд-кэпированы, но это не помогает увы...

[Deminolog]

Я не случайно задал этот вопрос. Вы же прекрасно понимаете, что эндкеппинг призван закрыть остаточные силанольные группы. Ведь степень сшивки (или загрузки углеродом, если дословно переводить Carbon loading) достаточно мала. Но даже без эндкеппинга они достаточно труднодоступны (стерический фактор), хотя будучи открытыми играют довольно серьезную роль.
Вы используете изократику или градиентный режим элюирования?

[Алексей Хрущёв]

Есть энд-кеппинг, про силанольные группы я знаю Используем градиентный режим.

[Deminolog]

Эт хорошо Вы уж простите за лекции
А подробнее? От какого соотношения вода:ацетонитрил до какого? Сколько объемов колонки закладываются на промывку и установление равновесия перед следующим вколом?

[Алексей Хрущёв]

От 10% B до 40% В за 40мин.
А- 0,1% уксус в воде
В -ацетонитрил

Уравновешивание до выравнивания базовой линии, от 5 до 10 объемов.

[Deminolog]

Попробуйте увеличить долю ацетонитрила. Мне кажется, это может помочь

[Алексей Хрущёв]

Так естественно пробовал не помогает...

[Любитель_Манниха]

А какие загрузки? Если колоть меньшие концентрации снижать - та же история? И сколько там, на вскидку, собственно примесей?
Если ли стандартные образцы, если есть, как они себя ведут? Если примеси полимерного характера, то надо как-то от них предварительно чиститься, ИМХО.

PS: Мне как-то кажется, что тут дело не во взаимодействии с силанольными группами (если колонка нормальная). Наверняка есть жЫрные фрагменты в молекулах?

PPS: а TFA потом проблема убрать?

[Алексей Хрущёв]

А какие загрузки? Если колоть меньшие концентрации снижать - та же история? И сколько там, на вскидку, собственно примесей?
Если ли стандартные образцы, если есть, как они себя ведут? Если примеси полимерного характера, то надо как-то от них предварительно чиститься, ИМХО.

PS: Мне как-то кажется, что тут дело не во взаимодействии с силанольными группами (если колонка нормальная). Наверняка есть жЫрные фрагменты в молекулах?

PPS: а TFA потом проблема убрать?

На 20мм колонку грузили от 50 до 150 мг результат тот же. Примесей бывает по-разному от 20 до 50%, примеси имеют родственную природу, т.е. пептиды с пропуском аминокислотных остатков, с недоснятыми защитами и т.д. C ТФУ тоже не все однозначно для некоторых соединений и она не помогает, а избавляться от нее придется на той же колонке но в безбуферной среде с большими потерями.

[Алексей Хрущёв]

Препаративщики, ау!
Как же бороться с силанольными группами? Пробовал модифицировать сорбент раствором триметилхлорсилана в хлористом метилене, но безуспешно - сорбция в модельных экспериментах составляет около 40%.

[Любитель_Манниха]

Пробовал модифицировать сорбент раствором триметилхлорсилана в хлористом метилене

Фирменный эндкепированный сорбент C-18 модифицировать TMSCl?
А что говорит литература по поводу хроматографии подобных веществ? Обычно от этого и пляшут.
Может там вообще нужен сорбент не на основе силикагеля.
Да, и - колонка нормальная, тестируете?

PS: позовите в тему Upstream, чтоле, не знаю, заглядывает ли он в аналитику
Да и вообще, раз тема про препаратив, имеет смысл попросить модераторов перенести в органику.

[Алексей Хрущёв]

Нет, для модификации я взял дешевый не энд-кэпированный сорбент.
Да вещество то собственно обычное - пептид как пептид по большому счету, нигде не удалось найти особых указаний по данному вопросу. Я так понимаю люди просто забивают на эту проблему, ну потерялось 30%-50% да и ладно, издержки производства, так сказать...
Сорбенты на основе полимерной матрицы наверно были бы решением проблемы, но стоят они огого (надо набить колонку 150х500мм)