Тест Кайзера в SPPS

форум для специалистов в области органической химии
organic chemistry issues discussion for professional scientists
Ответить
sidhar
Сообщения: 435
Зарегистрирован: Вс ноя 19, 2006 8:52 pm

Тест Кайзера в SPPS

Сообщение sidhar » Пт окт 08, 2021 3:36 pm

Добрый день.
Прошу совета.
Занялся SPPS. При положительном тесте Кайзера (речь не идет о специфических АК) окрашивается в синий цвет раствор и бусинки, в теории.
1) Было ли у кого, чтобы окрашивался только раствор, или только бусинки? Сами бусинки должны быть сплошного синего цвета?

2) Пример: делаю тест, раствор синий, якобы не полностью проацилировался. Деблокирую полностью образец смолы и образец исходного амина на смоле, по ВЭЖХ нет исходника, т.е. полностью проацилировался.
Заливаю смолу бензоилхлоридом - тест - синий. Что делаю не так?

3) Сначала вообще думал, что все ацилирование проходит полностью, потому что не заморачивался с контролем температуры, ставил виалки с пробой на плитку 200 град (термометром грубо прикинул, что вроде около 100 град). В итоге р-р сначала становился синим, потом желтел. Считал тест отриц. Потом выяснил, что температура была сильно выше, но: почему синий переходит в желтый? Может быть наоборот, желтый перейти в синий, если перегреть, послетел Fmoc или Boc например.

Nickolas
Сообщения: 1530
Зарегистрирован: Пн авг 27, 2007 8:15 pm

Re: Тест Кайзера в SPPS

Сообщение Nickolas » Пт окт 08, 2021 6:55 pm

У нас при нагревании сперва смола синеет а потом секунд через 10-20 становится голубым и раствор, если есть свободные аминогруппы.
Тест очень чувствительный, поэтому даже если есть пару процентов свободного амина, то раствор синеет достаточно отчетливо.
А без смолы у вас раствор тоже становится синим при нагреве или нет?
И что у вас еще на смоле есть?
Кстати одного бензоилхлорида может и не хватить, к нему нужно еще основание.

Cherep
Сообщения: 23303
Зарегистрирован: Чт окт 30, 2003 9:22 am

Re: Тест Кайзера в SPPS

Сообщение Cherep » Пт окт 08, 2021 7:28 pm

Цветовая гамма и интимные подробности приготовления реагентов для теста подробно описаны в мануале Стюарта и Янга (и истественно в первоисточнике от дяди Кайзера).

Код: Выделить всё

http://library.lol/main/558A4B2489F4B1D3BEC338FFF5E21074
В сухом остатке: когда аминогрупп дохрена, окрашивается всё. Когда аминогрупп совсем мало, но есть ещё 1-0.5 % (ЕМНИП) раствор жёлтый, а шарики голубоватые или зеленоватые.
В указанном мануале полно иной теоретической и практической информации.

Из скромного личного опыта: для приготовления одного из реагентов у нас в колхозе традиционно берут пиридин перегоняемый над нингидрином несколько раз повторно, так, чтобы в кубовом остатке не было никакой окраски. Иначе тесты будут ложно-положительные. :shuffle:

Кроме того, тётушки в нашем колхозе греют образца пептидил-полимера в продырявленных иглой от шприца в крышке (!) эппендорфах на парафиновой бане, которая стоит в маленьком термошкафу, отрегулированном на температуру из мануала. Пачка эппендорфов перед использованием проверяется на наличие ложно-положительной синей окраски из материала, из которого эппендорф сделан.

Наконец, есть мнение (покойный Upstream показывал распечатку каких-то тезисов), что пиридин в этой смесюге подваливает Fmoc :arrow: опять ложно-положительное. Для этого там была рекомендация добавлять сколько-то капель уксусной.

Остаточные амино-группы кэппируют бензойным ангидридом, а не хлорангидридом с добавкой основания.

ЗЫ А этот Fmoc/tBu -- вообще отстой, точнее оно -- не труЪ. :mrgreen:

Nickolas
Сообщения: 1530
Зарегистрирован: Пн авг 27, 2007 8:15 pm

Re: Тест Кайзера в SPPS

Сообщение Nickolas » Пт окт 08, 2021 8:07 pm

Cherep писал(а):
Пт окт 08, 2021 7:28 pm
Остаточные амино-группы кэппируют бензойным ангидридом, а не хлорангидридом с добавкой основания.
В качестве теста наверное пойдет и BzCl с основанием, в для capping мы используем Ac2O/DIPEA/DMF.
что пиридин в этой смесюге подваливает Fmoc :arrow: опять ложно-положительное
Fmoc валится после недели-двух даже в растворе ДМФА (выпадают аминокислоты в осадок), а уж при нагревании да с пиридином, то и подавно. Хотя обычно одной-двух минут нагревания для этого, как правило, не достаточно.

sidhar
Сообщения: 435
Зарегистрирован: Вс ноя 19, 2006 8:52 pm

Re: Тест Кайзера в SPPS

Сообщение sidhar » Пт окт 08, 2021 9:06 pm

Раствор в некоторых случаях бледно-голубой, в некоторых интенсивно-синий, как будто результат положительный, но сами зерна вроде желто-прозрачные.
Смесь трех компонентов без смолы - желтоватая. В том числе при перегреве 150 град 20 мин, пиридин не дает положительный результат.
Бензоилхлорид (его предлагают в разл. источниках наряду с уксусным а.) с пиридином использую конечно. Еще и 3 раза последовательно обработал. Попробую укс.а.
Да, спасибо, читал, но везде пишут, что чаще зерна скорее синие, а р-р может быть желтоватым, а не наоборот. И почему при перегреве все желтеет (иногда слегка краснеет)?
Я решил, что раз холостой р-р Кайзера не синеет, то и норм пиридин. Перегоню. DMF перегонял.

"проверяется на наличие ложно-положительной синей окраски из материала, из которого эппендорф сделан"
как? смешать три компонента и нагреть, верно?

" пиридин в этой смесюге подваливает Fmoc"
"а уж при нагревании да с пиридином, то и подавно"
да, такое бывает, но тогда при перегреве он еще сильнее подвалит Fmoc и цвет будет более интенсивный синий, а не пожелтеет, нет?

sidhar
Сообщения: 435
Зарегистрирован: Вс ноя 19, 2006 8:52 pm

Re: Тест Кайзера в SPPS

Сообщение sidhar » Пн окт 11, 2021 4:12 pm

Почитал старые статьи про тест Кайзера. При перегреве видимо краситель Рунемана разрушается. KCN берут для стабильного окраски, в некоторых случаях можно и без него, проверил.
Если смешать три компонента и 100 град - слабый сине-зеленый цвет наблюдается. ДМФ перегонял.
Фото смолы после ацилирования:
Раствор ~фиолетовый, зерна зерна вроде нет.
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Cherep
Сообщения: 23303
Зарегистрирован: Чт окт 30, 2003 9:22 am

Re: Тест Кайзера в SPPS

Сообщение Cherep » Вт окт 12, 2021 6:08 pm

sidhar писал(а):
Пн окт 11, 2021 4:12 pm
Если смешать три компонента и 100 град - слабый сине-зеленый цвет наблюдается. ДМФ перегонял.

Фото смолы после ацилирования:
Раствор ~фиолетовый, зерна зерна вроде нет.
А вы можете сфотографировать реакционные сосуды с тестами без такого увеличения, а то ничего фиолетового не видно. :dontknow:

Ответить

Вернуться в «органическая химия / organic chemistry»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 17 гостей