Тест Кайзера в SPPS
Тест Кайзера в SPPS
Добрый день.
Прошу совета.
Занялся SPPS. При положительном тесте Кайзера (речь не идет о специфических АК) окрашивается в синий цвет раствор и бусинки, в теории.
1) Было ли у кого, чтобы окрашивался только раствор, или только бусинки? Сами бусинки должны быть сплошного синего цвета?
2) Пример: делаю тест, раствор синий, якобы не полностью проацилировался. Деблокирую полностью образец смолы и образец исходного амина на смоле, по ВЭЖХ нет исходника, т.е. полностью проацилировался.
Заливаю смолу бензоилхлоридом - тест - синий. Что делаю не так?
3) Сначала вообще думал, что все ацилирование проходит полностью, потому что не заморачивался с контролем температуры, ставил виалки с пробой на плитку 200 град (термометром грубо прикинул, что вроде около 100 град). В итоге р-р сначала становился синим, потом желтел. Считал тест отриц. Потом выяснил, что температура была сильно выше, но: почему синий переходит в желтый? Может быть наоборот, желтый перейти в синий, если перегреть, послетел Fmoc или Boc например.
Прошу совета.
Занялся SPPS. При положительном тесте Кайзера (речь не идет о специфических АК) окрашивается в синий цвет раствор и бусинки, в теории.
1) Было ли у кого, чтобы окрашивался только раствор, или только бусинки? Сами бусинки должны быть сплошного синего цвета?
2) Пример: делаю тест, раствор синий, якобы не полностью проацилировался. Деблокирую полностью образец смолы и образец исходного амина на смоле, по ВЭЖХ нет исходника, т.е. полностью проацилировался.
Заливаю смолу бензоилхлоридом - тест - синий. Что делаю не так?
3) Сначала вообще думал, что все ацилирование проходит полностью, потому что не заморачивался с контролем температуры, ставил виалки с пробой на плитку 200 град (термометром грубо прикинул, что вроде около 100 град). В итоге р-р сначала становился синим, потом желтел. Считал тест отриц. Потом выяснил, что температура была сильно выше, но: почему синий переходит в желтый? Может быть наоборот, желтый перейти в синий, если перегреть, послетел Fmoc или Boc например.
Re: Тест Кайзера в SPPS
У нас при нагревании сперва смола синеет а потом секунд через 10-20 становится голубым и раствор, если есть свободные аминогруппы.
Тест очень чувствительный, поэтому даже если есть пару процентов свободного амина, то раствор синеет достаточно отчетливо.
А без смолы у вас раствор тоже становится синим при нагреве или нет?
И что у вас еще на смоле есть?
Кстати одного бензоилхлорида может и не хватить, к нему нужно еще основание.
Тест очень чувствительный, поэтому даже если есть пару процентов свободного амина, то раствор синеет достаточно отчетливо.
А без смолы у вас раствор тоже становится синим при нагреве или нет?
И что у вас еще на смоле есть?
Кстати одного бензоилхлорида может и не хватить, к нему нужно еще основание.
Re: Тест Кайзера в SPPS
Цветовая гамма и интимные подробности приготовления реагентов для теста подробно описаны в мануале Стюарта и Янга (и истественно в первоисточнике от дяди Кайзера).
В сухом остатке: когда аминогрупп дохрена, окрашивается всё. Когда аминогрупп совсем мало, но есть ещё 1-0.5 % (ЕМНИП) раствор жёлтый, а шарики голубоватые или зеленоватые.
В указанном мануале полно иной теоретической и практической информации.
Из скромного личного опыта: для приготовления одного из реагентов у нас в колхозе традиционно берут пиридин перегоняемый над нингидрином несколько раз повторно, так, чтобы в кубовом остатке не было никакой окраски. Иначе тесты будут ложно-положительные.
Кроме того, тётушки в нашем колхозе греют образца пептидил-полимера в продырявленных иглой от шприца в крышке (!) эппендорфах на парафиновой бане, которая стоит в маленьком термошкафу, отрегулированном на температуру из мануала. Пачка эппендорфов перед использованием проверяется на наличие ложно-положительной синей окраски из материала, из которого эппендорф сделан.
Наконец, есть мнение (покойный Upstream показывал распечатку каких-то тезисов), что пиридин в этой смесюге подваливает Fmoc опять ложно-положительное. Для этого там была рекомендация добавлять сколько-то капель уксусной.
Остаточные амино-группы кэппируют бензойным ангидридом, а не хлорангидридом с добавкой основания.
ЗЫ А этот Fmoc/tBu -- вообще отстой, точнее оно -- не труЪ.
Код: Выделить всё
http://library.lol/main/558A4B2489F4B1D3BEC338FFF5E21074
В указанном мануале полно иной теоретической и практической информации.
Из скромного личного опыта: для приготовления одного из реагентов у нас в колхозе традиционно берут пиридин перегоняемый над нингидрином несколько раз повторно, так, чтобы в кубовом остатке не было никакой окраски. Иначе тесты будут ложно-положительные.
Кроме того, тётушки в нашем колхозе греют образца пептидил-полимера в продырявленных иглой от шприца в крышке (!) эппендорфах на парафиновой бане, которая стоит в маленьком термошкафу, отрегулированном на температуру из мануала. Пачка эппендорфов перед использованием проверяется на наличие ложно-положительной синей окраски из материала, из которого эппендорф сделан.
Наконец, есть мнение (покойный Upstream показывал распечатку каких-то тезисов), что пиридин в этой смесюге подваливает Fmoc опять ложно-положительное. Для этого там была рекомендация добавлять сколько-то капель уксусной.
Остаточные амино-группы кэппируют бензойным ангидридом, а не хлорангидридом с добавкой основания.
ЗЫ А этот Fmoc/tBu -- вообще отстой, точнее оно -- не труЪ.
Re: Тест Кайзера в SPPS
В качестве теста наверное пойдет и BzCl с основанием, в для capping мы используем Ac2O/DIPEA/DMF.
Fmoc валится после недели-двух даже в растворе ДМФА (выпадают аминокислоты в осадок), а уж при нагревании да с пиридином, то и подавно. Хотя обычно одной-двух минут нагревания для этого, как правило, не достаточно.что пиридин в этой смесюге подваливает Fmoc опять ложно-положительное
Re: Тест Кайзера в SPPS
Раствор в некоторых случаях бледно-голубой, в некоторых интенсивно-синий, как будто результат положительный, но сами зерна вроде желто-прозрачные.
Смесь трех компонентов без смолы - желтоватая. В том числе при перегреве 150 град 20 мин, пиридин не дает положительный результат.
Бензоилхлорид (его предлагают в разл. источниках наряду с уксусным а.) с пиридином использую конечно. Еще и 3 раза последовательно обработал. Попробую укс.а.
Да, спасибо, читал, но везде пишут, что чаще зерна скорее синие, а р-р может быть желтоватым, а не наоборот. И почему при перегреве все желтеет (иногда слегка краснеет)?
Я решил, что раз холостой р-р Кайзера не синеет, то и норм пиридин. Перегоню. DMF перегонял.
"проверяется на наличие ложно-положительной синей окраски из материала, из которого эппендорф сделан"
как? смешать три компонента и нагреть, верно?
" пиридин в этой смесюге подваливает Fmoc"
"а уж при нагревании да с пиридином, то и подавно"
да, такое бывает, но тогда при перегреве он еще сильнее подвалит Fmoc и цвет будет более интенсивный синий, а не пожелтеет, нет?
Смесь трех компонентов без смолы - желтоватая. В том числе при перегреве 150 град 20 мин, пиридин не дает положительный результат.
Бензоилхлорид (его предлагают в разл. источниках наряду с уксусным а.) с пиридином использую конечно. Еще и 3 раза последовательно обработал. Попробую укс.а.
Да, спасибо, читал, но везде пишут, что чаще зерна скорее синие, а р-р может быть желтоватым, а не наоборот. И почему при перегреве все желтеет (иногда слегка краснеет)?
Я решил, что раз холостой р-р Кайзера не синеет, то и норм пиридин. Перегоню. DMF перегонял.
"проверяется на наличие ложно-положительной синей окраски из материала, из которого эппендорф сделан"
как? смешать три компонента и нагреть, верно?
" пиридин в этой смесюге подваливает Fmoc"
"а уж при нагревании да с пиридином, то и подавно"
да, такое бывает, но тогда при перегреве он еще сильнее подвалит Fmoc и цвет будет более интенсивный синий, а не пожелтеет, нет?
Re: Тест Кайзера в SPPS
Почитал старые статьи про тест Кайзера. При перегреве видимо краситель Рунемана разрушается. KCN берут для стабильного окраски, в некоторых случаях можно и без него, проверил.
Если смешать три компонента и 100 град - слабый сине-зеленый цвет наблюдается. ДМФ перегонял.
Фото смолы после ацилирования:
Раствор ~фиолетовый, зерна зерна вроде нет.
Если смешать три компонента и 100 град - слабый сине-зеленый цвет наблюдается. ДМФ перегонял.
Фото смолы после ацилирования:
Раствор ~фиолетовый, зерна зерна вроде нет.
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.
Re: Тест Кайзера в SPPS
А вы можете сфотографировать реакционные сосуды с тестами без такого увеличения, а то ничего фиолетового не видно.
Кто сейчас на конференции
Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 17 гостей