Ошибка в синтезе пептидов

[Upstream]

Дорогая Юля!
Если Вы думаете, что человеку на пятом десятке больше нечем заняться, кроме как грузить и запугивать горячую эстонскую девушку несуществующими химическими ужастиками, то Вы сильно обольщаетесь на свой счёт. К сожалению, ваша последняя фраза

перемешиваю кислоту буквально двумя трясками, то есть 2сек.

говорит о том, что суть проблемы я до Вас таки не донёс. Сдаюсь! Меня уже это достало: с 1998 года я писал по поводу этих граблей раз 10 вот на этом форуме:

Код: Выделить всё

http://www.abrf.org/index.cfm/list.home

В чём с лёгкостью можно убедиться, набрав в поисковом окошке слово tetramethylguanidinium.
Что касается мнения уважаемого Gugu, то оно отражает точку зрения нормального химика-органика, не искушённого в твердофазном синтезе пептидов (ТФСП), и в этой теме совершенно неуместно! Для нормального химика-органика выход реакции в 90% = просто блеск; 95% = лучше не бывает; 99% = нереально хорош, а уж борьба за 0.5% в диапазоне 99-99,8% - это полный маразм и паранойя. Согласен! Только имейте в виду, что применительно к постадийному выходу в хорошем ТФСП ситуация - прямо противоположная!

[Semenych]

Для нормального химика-органика выход реакции в 90% = просто блеск; 95% = лучше не бывает; 99% = нереально хорош, а уж борьба за 0.5% в диапазоне 99-99,8% - это полный маразм и паранойя.

на редкость верно

[gugu]

Коллеги. Если у топикстартера полностью блокируется аминогруппа на смоле, то TBTU и используемый порядок добавления реагентов не имеют к этому никакого отношения. ИМХО. Нужно искать другие причины.

[Cherep]

про полностью блокируется речь не шла. речь шла о том, что конечного продукта нет по результатам масс-спектрометрии.

коллега Upstream пишет, что проблема в конечном итоге из-за терминирования на каждой стадии.
масса пептида 1700 единиц, значит гдето 13-15 членик.
10%, а то и больше терминирования на каждой стадии -- и нет нужной массы.

Другое дело, что топикстартер пишет, что выход в граммах очень мал

Но последние 4 месяца от ручного синтеза остается 0,1 мг непонятно чего!

как вариант, Ринк прогуанидилировался намертво при присоединении первой АК, которая не проактивировалсь в отсутвии основания.

[gugu]

Однако спектра я не вижу, что обозначает только то, что на резин не прикрепилась ни одна кислота.

как вариант, Ринк прогуанидилировался намертво при присоединении первой АК, которая не проактивировалсь в отсутвии основания.

Cherep, именно это и кажется мне крайне маловероятным.

[Cherep]

а мы спектра и не видели, кстати

[Upstream]

Коллеги. Если у топикстартера полностью блокируется аминогруппа на смоле, то TBTU и используемый порядок добавления реагентов не имеют к этому никакого отношения. ИМХО. Нужно искать другие причины.
<...> Cherep, именно это и кажется мне крайне маловероятным.

Коллега Gugu:
Когда имеются твёрдо установленные факты, которые опубликованны в доступных изданиях (на которые я сослался выше), игнорировать их и одновременно излагать сомнения и гипотезы с оговорками "ИМХО"/"кажется мне" - по меньшей мере непрофессионально! Вы имеете полное право не верить мне на слово и не желать читать первоисточники. Однако, это - не повод превращать обмен достоверной информацией в плюралистический балаган под лозунгом: "Одним больше нравится попадья, а другим - свиной хрящик."

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Sent: Tuesday, August 08, 2000 12:52 PM
To: Recipients of ABRF List
Cc: Chemistry
Subject: PepSyn

If you are biotinylating with Biotin-NHS, and using HBTU to couple it, that is your problem. We had the same problem. We then synthesized (FMOC SPPS with Merrifield resin) the peptide up to the addition of the biotin & checked the integrity of the synthesis. It was OK. Couple the biotin-NHS with HBTU and voila, deletion peptide with biotin. Something to do with the NHS and HBTU. Now, this didn't happen every time we biotinylated using this method, only every once in a while. Going back and looking at all the sequences this happened to, we could find no common amino acid or stretch of amino acids present to explain what was going on. It appears to be "sequence dependent"; those magic words used to explain why peptides screw up when you don't know why. We too are a production lab and don't have any time to look into the why of things.
We went back to manually coupling Biotin-NHS with HOBt only and have had no problems since.

Anita Everson
Peptide Lab, R W Johnson PRI, La Jolla, CA

Sent: Thursday, April 01, 2004 1:53 PM
To: ABRF@list.abrf.org
Subject: Biotinylation of N-terminus of synthetic peptide

Hi All, I did an amino terminal biotinylation of a peptide I was synthesizing using Biotin-OSu from NovaBiochem. I also needed some of the peptide un-biotinylated so I synthesized the peptide on my 433, took out half the resin and biotinylated the rest using a modified A module (no cartridge read and an interrupt allowing me to take out the resin plus put up a cartridge containing the biotin-OSu dissolved in DMSO) followed by DEFDc. My coupling times were also increased. I used Fastmoc chemistry with HATU as the activator. I cleaved the peptide off the resin using Reagent R.

What I seem to have gotten was a whole lot of peptide that I believe has OSu attached to it (+98 by LC/MS) and only a bit of peptide with biotin attached to it (+226). The peptide that was removed prior to the biotinylation has the correct molecular weight. Where did the biotinylation go wrong? I am assuming that the biotin got cleaved away instead of the OSu, but why? Most importantly, how can I keep from having it happen again? Is there any chance the OSu might have migrated somewhere else? The peptide contains the following amino acids L, S, H, P, and Q. In case it matters, the N-terminal amino acid is a leucine. Is there an easy way to get the OSu back off?

Judy Landin

[gugu]

Коллега Upstream. Не надо приписывать мне мнение, которое я не высказываю. Пожалуйста. Гуанидилирование это известная побочная реакция при избытке амина и HBTU/TBTU. Я просто пытаюсь сказать, что она сравнительно медленная и не может вести к тем серьезным проблемам, с которыми сталкивается Marionette. Если интересно, то вот описание промышленного процесса на Шеринге. Особенно обратите внимание на порядок подачи реагентов.

[Marionette]

Ув. Upstream!
Нежели Вы и в жизни так быстро сдаетесь? Почему-то я так не думаю (учитывая Ваш опыт и знание, например, данной проблемы).
Я действительно чего-то недопонимаю, но это какраз-таки из-за моей неопытности. В синтезе пептидов я новичок, именно поэтому обратилась за помощью к российскому форуму химиков (думала, что мы - русские, всегда готовы прийти на помощь и так оно и оказалось).

По теме: сейчас синтезирую вручную аналитическим ДМФА. С одним пептидом возникла проблема. В данный момент отказалась от TBTU и прикрепляю аминокислоты при помощи PyBOP'а. Но, к сожалению, с ним тоже реакция присоединения не идет (опираюсь на нингидрин. тест - получаю позитивный результат, то есть синий цвет). Если мне не изменяет память, то в тех статьях, которые Вы, Upstream, вначале выложили было написано, что использование PyBOP'а может исправить проблему?

Спасибо за английский источник, будет что показать начальству Просто переводить с русского на эстонский язык работа не из легких. (особенно такой большой текст)

Все еще надеясь на вашу помощь,
Юлия

[Marionette]

Говоря о спектре. В первом посте неверно выразилась. На некоторых спектрах можно видеть, что какие-то химикаты (может и кислоты) все-таки прекрепляются к резину. Когда доберусь до работы, то постараюсь выложить спектр сюда на форум. Есть правда одна интересная масса, которая вылезает абсолютно всегда на спектре - 649? Один коллега с Тарту предположил, что дело в матрице, которую я использую для проявления массы спектра. Тогда я сделала новую матрицу (DHB matrix 10,0mg + 500ul AcN + 500ul MetOH). Но все равно масса 649 проявляется, правда не на всех пептидах, что и заставляет задуматься.

[gugu]

Чтобы расставить все точки над i. Есть два варианта:
1. Вы активируете сначала карбоксильную компоненту ТБТУ или другими реагентами, и добавляете потом аминную компоненту (не важно какую, свободную или на полимере). Активированная кислота болтается при этом некоторое время в растворе без дела и неизбежно частично рацемизуется. Выход пептида потом может быть великолепный, но вот его диастереомерная чистота может быть паршивой, и лишние пики в спектре придется объяснять образованием мифических ротамеров.
2. Вы используете метод с практически одновременным добавлением всех реагентов, т.е примерно то, что и делала Marionette. Естественно, что тут может образовываться некоторое количество гуанидинов, но очень мало. Преимущества тут два: меньше рацемизации, а все гуанидинсодержащие обрубки легко отделяются хроматографией, по причине сильной основности гуанидильной группы.

Кстати, PyBOP и в самом деле лучше TBTU. Была возможность сравнить их на одном трудном синтезе. PyBOP дал 1% рацемизации, а TBTU - 3%. И еще: "HBTU can react with amino polymer decreasing coupling yield, whereas it is not the case for BOP." Статью прилагаю.

[Cherep]

По достаточно обширному опыту общения с TBTU могу сказать, что этот реагент достаточно индифферентен к аминогруппам, и порядок добавления реагентов не играет при его использовании большой роли.

угу, а в статьях написано, что не индефферентен