Потеря вещества на колонке

[StYV]

Эндкэппинг: триметилхлорсилан в толуоле - сутки.
Попробуйте фосфорную кислоту.
Заменить на изопропанол.
А вообще посмотреть журналы по хроматографии в издательстве Эльзевир.
С уважением StYV.

[Алексей Хрущёв]

Эндкэппинг: триметилхлорсилан в толуоле - сутки.
Попробуйте фосфорную кислоту.
Заменить на изопропанол.
А вообще посмотреть журналы по хроматографии в издательстве Эльзевир.
С уважением StYV.

Я всегда силилировал стеклянную посуду в дихлорметане вот и с сорбентом решил использовать этот растворитель, спасибо за совет, попробую сегодня. А не лучше ли будет использовать более полярные растворители, ацетонитрил например?
Еще вы предлагаете использовать фосфорную кислоту, я так понимаю в качестве компонента буферной системы? Мы использовали фосфатные буферы с рН 6 в крайних случаях, на самом деле это помогает, но для препа такой подход не годится - в готовом продукте анинонов быть не должно, фри бэйз будь он неладен для некоторых веществ допустим ацетат.
С изопропанолом все тоже самое.

[FOX-7]

ну а если на метанол заменить если уж совсем беда и садится?! Ну так аккуратно, чтобы примеси не смыть.

[A_V_B]

С-18 сорбенты, в т.ч. эндкепированые очень-очень сильно отличаются друг от друга, см, например
http://www.docstoc.com/docs/24844596/Co ... LC-Columns

Вполне возможно, что для этих пептидов нужен сорбент, имеющий пониженное сродство к основным соединениям, а Jupiter (сам я этого не знаю, в описаниях сорбента не нашёл ничего об этом), может быть, к таким не относится.

Может быть надо работать в основных условиях (элюэнт с аммиаком или триэтиламином, они улетят при упаривании, но колонна будет жить меньше). Я для работы с основными соединениями в щелочных условиях использовал Jemini. Успешно.

Кроме того, если вы на С18 делите реакционную смесь, в которой противоионы - "жирные" = липофильные кислоты, то они в виде соль с пептидом могут садиться весьма крепко на сорбент. Как с этим бороться - . Может тоже работать в основных условиях?

[Алексей Хрущёв]

ну а если на метанол заменить если уж совсем беда и садится?! Ну так аккуратно, чтобы примеси не смыть.

Метанол применять не пробовали, но у нас это не приживется - слишком дорого и ядовит он зараза.

[Алексей Хрущёв]

С-18 сорбенты, в т.ч. эндкепированые очень-очень сильно отличаются друг от друга, см, например
http://www.docstoc.com/docs/24844596/Co ... LC-Columns

Вполне возможно, что для этих пептидов нужен сорбент, имеющий пониженное сродство к основным соединениям, а Jupiter (сам я этого не знаю, в описаниях сорбента не нашёл ничего об этом), может быть, к таким не относится.

Может быть надо работать в основных условиях (элюэнт с аммиаком или триэтиламином, они улетят при упаривании, но колонна будет жить меньше). Я для работы с основными соединениями в щелочных условиях использовал Jemini. Успешно.

Кроме того, если вы на С18 делите реакционную смесь, в которой противоионы - "жирные" = липофильные кислоты, то они в виде соль с пептидом могут садиться весьма крепко на сорбент. Как с этим бороться - . Может тоже работать в основных условиях?

Имеющиеся колонки и сорбенты плохо переносят оснОвный рН, используем максимум 6.
Еще такой вопрос: как можно обессолить вещество? Допустим проводили хроматографию в 0,1% ТФУ, а надо добиться чтобы ее в конечном продукте не было. Мы используем хроматографию в безбуферной среде, по сути это вариант твердофазной экстракции: наносим вещество в воде на колонку и после того как соли вымоются смываем его ацетонитрилом, все бы хорошо, но в безбуферной среде сорбция на колонку сильно возрастает... Может есть еще какие-нибудь подходы. Под веществами имеется в виду короткие пептиды по 5-10 остатков, общий заряд положительный.

[FOX-7]

Метанол применять не пробовали, но у нас это не приживется - слишком дорого и ядовит он зараза.

ну мы нормально с ним работаем. Живы и здоровы. Насчет цены, конечно спорно.
Можно еще пептиды чистить и на более простых - ионообменных смолах. Правда у нас одновременно идет и смена аниона.

[FOX-7]

Еще такой вопрос: как можно обессолить вещество? Допустим проводили хроматографию в 0,1% ТФУ, а надо добиться чтобы ее в конечном продукте не было. Мы используем хроматографию в безбуферной среде, по сути это вариант твердофазной экстракции: наносим вещество в воде на колонку и после того как соли вымоются смываем его ацетонитрилом, все бы хорошо, но в безбуферной среде сорбция на колонку сильно возрастает... Может есть еще какие-нибудь подходы. Под веществами имеется в виду короткие пептиды по 5-10 остатков, общий заряд положительный.

Ну потом можно этот раствор покрутить в реакторе с основной смолой (анионитом) и отфильтровать.

[A_V_B]

Имеющиеся колонки и сорбенты плохо переносят оснОвный рН, используем максимум 6.
Еще такой вопрос: как можно обессолить вещество? Допустим проводили хроматографию в 0,1% ТФУ, а надо добиться чтобы ее в конечном продукте не было. Мы используем хроматографию в безбуферной среде, по сути это вариант твердофазной экстракции: наносим вещество в воде на колонку и после того как соли вымоются смываем его ацетонитрилом, все бы хорошо, но в безбуферной среде сорбция на колонку сильно возрастает... Может есть еще какие-нибудь подходы. Под веществами имеется в виду короткие пептиды по 5-10 остатков, общий заряд положительный.

Далеко не со всеми С18 (даже наоборот, с подавляющми большинством С18) нельзя работать в чистой воде без >5% органики. Сорбент "схлопывается". Это обратимо, но не в условиях одного вкола.

Мне кажется, что для таких веществ с наличием сильноосновных групп вам по любому для разделения необходимо наличие противоионов в растворе, иначе горбопики должны получаться. Например промывать несколькими объёмами 5% МеСN/0.1 М ацетат аммония, (он улетает в хорошем вакууме), затем ваш градиент (напр 5 - 40%МеСN/0.1 М ацетат аммония).

Ну и кроме того - выбор сорбента. Зачем Jupiter для таких коротких пептидов ?

[Алексей Хрущёв]

Ацетат аммония плохо улетает зараза, нужен очень глубокий вакуум, не очень это технологично. Юпитер 20х250 я указал как наиболее универсальную колонку, мы ее используем для мелкого препа, а для крупного - сферический сорбент С18, эндкэппированный, Premium Rf (Sorbent technologies), 100А, 40-75мкм, набиваем им колонку 150х500мм. А какой бы вы посоветовали сорбент для подобных пептидов?

[Serty]

... в готовом продукте анинонов быть не должно, фри бэйз будь он неладен

Для аргинин-содержащих это из области фантастики Гуанидин настолько сильное основание, что противоион будет обязательно, карбонат как минимум.
Кстати у нас активно(как основную) используют систему для препаратива водн. NH4HCO3/MeOH. На метанол перешли из-за его относительной дешевизны.

[A_V_B]

Ацетат аммония плохо улетает зараза, нужен очень глубокий вакуум, не очень это технологично. Юпитер 20х250 я указал как наиболее универсальную колонку, мы ее используем для мелкого препа, а для крупного - сферический сорбент С18, эндкэппированный, Premium Rf (Sorbent technologies), 100А, 40-75мкм, набиваем им колонку 150х500мм. А какой бы вы посоветовали сорбент для подобных пептидов?

Я почти не хроматографист и опыт работы с пептидами у меня ограничен. Но для не слишком больших и весьма основных соединений мы используем Luna C18(2) and Jemini. Отличия вроде бы есть, но не огромные. Последний вроде лучше держит высокие рН. Оба сорбента продаются как "Dulk HPLC Media", но эти мелкие сорбенты ещё надо запаковать....
Говорят, что WatersXBridge хорошо работает для основных веществ при высоких рН.

Просто засыпка всухую или заливка суспензии даёт отвратительный результат (вы писали, что примеси выходят близко). А большие готовые колонки стоят ну очень интересных денег.
Элюенты - TFA (но она вам не подходит) или формиат аммония, с доведением рН до нужного. Последний можно и в спиртах использовать. Опасность использования спиртов - возможна этерификация карбоксилов при упаривании. На это, если не ошибаюсь, нарвались в ИБХ при очистке инсулина в кислых водно - спиртовых элюентах .

[Serty]

...Элюенты - TFA (но она вам не подходит) или формиат аммония, с доведением рН до нужного. Последний можно и в спиртах использовать. Опасность использования спиртов - возможна этерификация карбоксилов при упаривании. На это, если не ошибаюсь, нарвались в ИБХ при очистке инсулина в кислых водно - спиртовых элюентах .

На это мы тоже нарывались с формиатными буферами. Кроме того если есть первичные/вторичные амины, то можно схлопотать при упаривании N-формильные производные.

[A_V_B]

Ацетат аммония плохо улетает зараза, нужен очень глубокий вакуум, не очень это технологично.

Ну тогда карбонат аммония и Jemini or XBridge. Если эти пептиды вудерживают такой щелочной рН.

[FOX-7]

Опасность использования спиртов - возможна этерификация карбоксилов при упаривании. На это, если не ошибаюсь, нарвались в ИБХ при очистке инсулина в кислых водно - спиртовых элюентах .

Да, действительно проблемы с кислыми спиртами были, даже у этерифицированных пептидов. Однако тут метанол с аммиаком

[Алексей Хрущёв]

Карбонат аммония легче улетает чем ацетат? Не подскажете что лучше подойдет для препа Jemini или XBridge? В отношении цена-качество? У первой вроде эффективная поверхность выше.

[Любитель_Манниха]

Бикарбонат очень хорошо улетает, он и при нагревании разлагается, с его удалением не должно быть никаких проблем.

[Алексей Хрущёв]

0,1М гидрокарбонат аммония даст примерно рН 6-7?

[StYV]

Для подбора селективности на обращенке четверная система : вода-метанол-ацетонитрил-тетрагидрофуран. ТГФ самый сильный из них. У Дюпона был хроматограф с компьютерной программой для оптимизации системы.
С уважением StYV.

[Алексей Хрущёв]

Разумно. Один раз делил производное салициловой кислоты на С18, так вот в метаноле оно садилось на 100% а в ацетонитриле прекрасный пик был.