Определение константы скорости быстрой реакции

[Алексей Соколов]

Стоит задача определить константу скорости реакции микроскопического красителя (поглощает при 650 нм) с гипохлоритом, реакция практически мгновенная и при концентрации красителя 25 мкМ и гипохлорита 12,5 мкМ заниженное значение скорости реакции около 6,6 мкМ/сек, это вряд ли адекватно отражает реальную скорость, то даже при этом константа скорости около 21250 /М*сек. Концентрацию понижать сильнее уже нельзя, поскольку будет не видно красителя. Со стоп-флоу никогда не работал и не знаю есть ли это у кого-нибудь в СПб? Буду благодарен за советы по теме.

[avor]

А вы не жадничайте. Что значит не видно возьмите кювету с длинной пути побольше, да фотоумножитель(детектор) по чувствительнее, думаю на порядок-два это позволит снизить концентрацию. Температуру понизьте.

[Maryna]

А температуру понизить? Проводить при нескольких низких, останавливать реакцию каким-нибудь реагентом, который мгновенно нейтрализует один из реагентов, не спеша определить второй, найти температурную зависимость константы скорости и проэкстраполировать.

[ИСН]

Всё бы прекрасно, но если "который мгновенно" - это они сами, тогда как? Быстро ли реагирует кислота со щёлочью? Для любых практических целей - мгновенно. Но если цель как раз в том и состоит, чтобы измерить это "мгновенно", тут - - -.
Слушайте, а может, подобрать другой краситель - который тоже окисляется, скажем, но на порядок медленнее, так что его скорость уже можно измерить - смешать его с нашим красителем, а потом бухнуть туда гипохлорит да посмотреть, сколько кого он выжрет?

[зыркало1]

При прочих равных - метод конкурирующих хорош...

[Алексей Соколов]

А вы не жадничайте. Что значит не видно возьмите кювету с длинной пути побольше, да фотоумножитель(детектор) по чувствительнее, думаю на порядок-два это позволит снизить концентрацию. Температуру понизьте.

К сожалению, кювета больше, чем 1 см в сф не влезает. Понижать температуру не могу, поскольку константа скорости нужна именно для комнатной температуры, поскольку именно при этой температуре предполагается измерять с помощью этого красителя скорость образования гипохлорита ферментом.

[Алексей Соколов]

А температуру понизить? Проводить при нескольких низких, останавливать реакцию каким-нибудь реагентом, который мгновенно нейтрализует один из реагентов, не спеша определить второй, найти температурную зависимость константы скорости и проэкстраполировать.

Температуру понижать не могу, есть вариант добавлять цистеин или метионин, которые эффективно конкурируют с красителем за гипохлорит, а потом измерять остаток красителя.

[avor]

--К сожалению, кювета больше, чем 1 см в сф не влезает
СФ ы они разные бывают есть и 10см кюветами.
Может проще гипохлорит мерить по спектру?

[Алексей Соколов]

Всё бы прекрасно, но если "который мгновенно" - это они сами, тогда как? Быстро ли реагирует кислота со щёлочью? Для любых практических целей - мгновенно. Но если цель как раз в том и состоит, чтобы измерить это "мгновенно", тут - - -.
Слушайте, а может, подобрать другой краситель - который тоже окисляется, скажем, но на порядок медленнее, так что его скорость уже можно измерить - смешать его с нашим красителем, а потом бухнуть туда гипохлорит да посмотреть, сколько кого он выжрет?

К сожалению, другой не могу, мне нужен был краситель с помощью которого можно было бы определять скорость продукции гипохлорита ферментом, был ряд жестких требований (устойчивость к действию пероксида водорода, стабильность максимума поглощения в диапазоне рН от 5 до 8 и чувствительность к гипохлориту) я проводил скрининг более 50 красителей и только один из них подошел, сейчас уже проделаны все нужные эксперименты по подбору условий реакции с ферментом, определены константы Михаэлиса для разных субстратов, изучено действие ингибиторов, даже более или менее удалось разобраться с продуктом реакции красителя и гипохлорита по масс-спектрометрии, но в приличный журнал без константы скорости вряд ли возьмут. С красителем за гипохлорит эффективно конкурируют только метионин (константа скорости 3,8*10(7) /М*сек) и цистеин (константа скорости 3,0*10(7) /М*сек), а гистидин (константа скорости 1,0*10(5) /М*сек) и глицин (константа скорости 1,0*10(5) /М*сек) уже не конкурируют с красителем, можно ли из этого сделать вывод, что константа скорости больше, чем 1,0*10(5) /М*сек?

[Алексей Соколов]

При прочих равных - метод конкурирующих хорош...

Спасибо, а можно в этом месте по подробнее? Например, если я знаю, что цистеин и метионин конкурируют, а гистидин и глицин не конкурируют, то что с этим делать?

[avor]

А еще проще плюнуть и считать что скорость реакции красителя намного больше скорости образования гипохлорита ферментом.

Или вот незадача вы уже сейчас не можете измерить скорость реакции без фермента. Зададимся вопросом: А когда эта скорость будет влиять на измерение скорости работы фермента? ответ: когда она будет со скоростью работы фермента соизмерима, или существенно медленнее ее. Но если скорость фермента будет таковой, как при этих условиях, вы просто не сможете ее измерить.

Мораль - не парьтесь, просто измеряйте скорость работы фермента с этой индикаторной реакцией, а там видно будет.

[Алексей Соколов]

--К сожалению, кювета больше, чем 1 см в сф не влезает
СФ ы они разные бывают есть и 10см кюветами.
Может проще гипохлорит мерить по спектру?

Боюсь у него слишком маленький молярный коэффициент для прямых измерений спектра, когда мы его определяем, то опять же коэффициент есть только для щелочного раствора, а нужны все-таки физиологические условия, у красителя опять же в УФ-области не слабое поглощение.
Спасибо, я почему-то зациклился на видимой области спектра, а ведь краситель гораздо сильнее в УФ-области поглощает и после хлорирования там тоже не хилые изменения, может быть смогу еще на порядок концентрацию понизить, если в этом диапазон работать.

[Алексей Соколов]

А еще проще плюнуть и считать что скорость реакции красителя намного больше скорости образования гипохлорита ферментом.

Или вот незадача вы уже сейчас не можете измерить скорость реакции без фермента. Зададимся вопросом: А когда эта скорость будет влиять на измерение скорости работы фермента? ответ: когда она будет со скоростью работы фермента соизмерима, или существенно медленнее ее. Но если скорость фермента будет таковой, как при этих условиях, вы просто не сможете ее измерить.

Мораль - не парьтесь, просто измеряйте скорость работы фермента с этой индикаторной реакцией, а там видно будет.

То, что скорость реакции красителя НАМНОГО больше "оборотистости" фермента - это я отлично знаю. Хорошо бы еще как бы сравнить новый метод с известными мишенями. Относительно недавно натолкнулся на статью в приличном зарубежном иммунологическом журнале, где утверждалось, что пептид, в котором 4 аргинина и 1 цистеин специфически ингибирует хлорирующую активность фермента и IC50 приводят 4 мкМ, при этом по условиям реакции в среде на выходе может по теории быть 40 мкМ гипохлорита. Т.е. люди добавили 4 мкМ пептида, что в итоге составляет 20 мкМ конкурирующих с мишенью за гипохлорит групп, и делают вывод о специфическом ингибировании фермента, причем они еще не поленились сделали ряд замен аминокислотных остатков и замена всех 4 аргининов на 4 лизина IC50 не изменила, а когда все аргинины и цистеин были заменены на аланины, то: надо же IC50 больше 40 мкМ.
Т.е. люди пишут об ингибировании фермента, но даже утруждают себя тем, чтобы проверить реакцию продукта реакции с ингибитором.
Спасибо за советы, я все-таки еще попарюсь

[Polychemist]

К сожалению, кювета больше, чем 1 см в сф не влезает.

Вы о чём? сф - это что? Подозреваю, что у Вас не советский СФ (или его аналоги), а гламурное нечто под квадратную кювету. Ну найдите у коллег нормальный прибор, их много, и Вам же на несколько измерений. И в наборах от советских СФ есть большие разборные УФ-кюветы, см на 10 однако.

[Maryna]

константа скорости нужна именно для комнатной температуры,

Это понятно. Можно проэкстраполировать, так часто делают

[Алексей Соколов]

К сожалению, кювета больше, чем 1 см в сф не влезает.

Вы о чём? сф - это что? Подозреваю, что у Вас не советский СФ (или его аналоги), а гламурное нечто под квадратную кювету. Ну найдите у коллег нормальный прибор, их много, и Вам же на несколько измерений. И в наборах от советских СФ есть большие разборные УФ-кюветы, см на 10 однако.

У меня в распоряжении СФ-2000-02, от ЛОМО (ОКБ-Спектр), там каретка такая, что максимум 1 см кювета влезает, когда у нас был практикум на химическом факультете СПбГУ, то там были кюветы на 5 и кажеться на 10 см оптического пути, но если к коллегам обращаться, то мне немного боязно вливать половину объема в такую большую кювету в чужом приборе, в своем-то я еще как-то приноровился струйно приливать 1 мл красителя к гипохлориту.
На самом деле, я думаю, что если я перейду в УФ-область, то там можно будет сильнее уменьшить концентрацию красителя и гипохлорита.
В любом случае спасибо за предложение.

[C10H16]

Если константа скорости обесцвечивания красителя с гипохлоритом во много раз больше константы скорости образования гипохлорита, то образование гипохлорита лимитирующий процесс, и по обесцвечиванию красителя можно изучать кинетику образования.

С красителем за гипохлорит эффективно конкурируют только метионин (константа скорости 3,8*10(7) /М*сек) и цистеин (константа скорости 3,0*10(7) /М*сек), а гистидин (константа скорости 1,0*10(5) /М*сек) и глицин (константа скорости 1,0*10(5) /М*сек) уже не конкурируют с красителем, можно ли из этого сделать вывод, что константа скорости больше, чем 1,0*10(5) /М*сек?

Да, такой вывод верен.

Я предлагаю не изучать кинетику этой реакции, что может оказаться достаточно сложно, а оценить константу скорости. Первый акт взаимодействия может быть либо диффузно-лимитируемым, либо иметь барьер активации. Активационный барьер можно квантово-химически оценить и на основе этой оценки вычислить константу скорости (К1), пусть даже приблизительно. Для случая диффузного лимитирования константу можно вычислить из теории Смолуховского (К2). Далее, сравниваем как К1 и К2 соотносятся с константами реакций метионина и цистеина с гипохлоритом.

[MONSTA]

При таких высоких скоростях (практически все мгновенно) лимитирует, похоже, именно диффузия. Я не спец, но, может, поиск конкретных примеров практического исследования любых диффузионно-лимитируемых реакций может помочь?

[C10H16]

MONSTA, коллега интуиция вам правильно подсказывает тоже самое и мне кажется: для противоположно заряженных однозарядных ионов в воде вычисленная константа составит порядка 10¹⁰ - 10¹¹ л*моль^-1*с^-1 [1]. В реальности эта константа получается немного ниже (обычно на 1-2 порядка) и традиционно составляет 10⁹ л*моль^-1*с^-1. Учитывая что размер молекулы красителя наверняка больше чем у гипохлорита возможно что константа будет как раз около 10⁷. Есть только один нюанс: если есть небольшой барьер активации порядок константы может не очень сильно отличаться. Или скажем константа лимитируемая диффузией будет 10⁸, а активационная как раз 10⁷. Собственно для этого и нужно сравнение. У меня в "закромах" есть статья где изучали кинетику реакций:
I₂ + I^- = I₃^-
Br₂ + Br^- = Br₃^-
Оказалось, что для йода константа где-то 10⁹ (если правильно помню), а для брома 10⁸ и у брома как-раз активационно-лимитируемая. Как найду статью - выложу.
Алексею очень рекомендую [1]:

[1] Е. Колдин. Быстрые реакции в растворах М.: Мир. 1966г.

[C10H16]

Кстати может быть вот ещё что:

нужно достаточно точно знать на какой стадии краситель перестаёт поглощать на длине волны 650 нм. А именно, реакция гипотетически может протекать в несколько элементарных стадий:
1)Краситель + ClO^- <=> [Краситель-ClO]^- (K₁=k₁/k_-1)
2)[Краситель-ClO]^- <=> [переходное состояние] (K₂=k₂/k_-2)
3)[переходное состояние] -> продукты (k3)
стадия 1 может быть диффузно-лимитируемой, стадия 2 - на активационном барьере, 3 после барьера. Если интермедиат [Краситель-ClO]^- уже не окрашен, то тогда всё в порядке. А вот если он теряет окраску на стадиях 2 или 3, то дело усложняется, т.к. измеряемая таким образом в ходе эксперимента наблюдаемая константа скорости не будет соответствовать константе связывания гипохлорита.