Определение белка по Бредфорду,(Куммасси блю),G-250

[Georg Gasparyan]

Добрый день уважаемые коллеги!...присоединяйтесь все кому данная методика знакома и желательно есть опыт!..сам этой методикой воспользовался совсем недавно накопилось огромное количество вопросов и наблюдений,надеюсь поможете...Заранее спасибо)

[avor]

Вопросы задавайте. а наблюдения сообщайте. Кой чего есть здесь viewtopic.php?f=12&t=91801

[Georg Gasparyan]

Огромное спасибо за ответ.Я готовил реагент Бредфорда по протоколу на 20 (мл).Для калибровки взял растворы альбумина в следующих концентрациях(10,20,30,40,,,,,до 100 мкг/мл)...Далее как и положено исследовал при помощи спектрофотометра при длине волны 595 нм.и все шло нормально,а именно вырисовывалась линейная прямая,но начиная с 6-ой пробы до 10 я получал одно и тоже число....это меня ввело в заблуждение я повторно просмотрел пердыдущие пробы т.е. с 1-ой по 6-ую и данные получил ментше чем были.. скажем...было 0,089 стало 0,077...0,096,,,стало 0,086...складывается впечатление что реагент ослаб.....какие есть мысли?)))

[avor]

При больших нагрузках белка линейная кривая превращается в загибающуюся, выходящую на плато. Кроме того все еще зависит от качества работы СФ на больших поглощениях я бы не рекомендовал рассматривать цифры поглощения больше 1.

Вообще для получения максимального поглощения реактив с белком выдерживают минут 5-15 чем больше белка тем больше требуется время выдержки. кроме того любой аналитик скажет что в одной точке надо делать хотя бы три измерения.

[Joni-Fantazi]

Можете ещё попробовать аналогичный метод с кумасси - Седмака. Там снимают при двух длинах волн и результаты стабильнее. Но в нашем случае получались заниженные результаты, может Вам повезёт больше.
А в книге Р. Досон и др. "Справочник биохимика" пишут, что бычий сывороточный альбумин не годится в качестве стандарта. Хотя за неимением другого мы им и пользуемся.

[Georg Gasparyan]

Огромное спасибо за столь полные ответы...Про то что альбумин не подходит не слышал,интересная новость...а что касается метода Седмака,аналогично не слышал))),но если честно мне не хотелось бы сейчас отходить от стандартов и хочу продолжить по Бредфорду просто собираемся поставить серию экспериментов...Товарищ AVOR именно в загибающуюся она и переходит но удивительно что это происходит при концентрации 60,70 мкг/мл...не считаю данную концентрацию нагрузкой..я выдерживал 5-7 минут...собираюсь повторить опыт,сообщу о новостях))

[avor]

--Товарищ AVOR именно в загибающуюся она и переходит но удивительно что это происходит при концентрации 60,70 мкг/мл...не считаю данную концентрацию нагрузкой..я выдерживал 5-7 минут...собираюсь повторить опыт,сообщу о новостях))

Если вы хотите что бы она загибалась попозже можно использовать чуть больше фосфорной кислоты, чем указано в прописи для приготовления. К тому же фосфорная кислота не всегда строго 85%, как описывают в оригинальной прописи, старая кислота хватает воду и концентрация становится меньше паспортной. При добавлении кислоты градуировка становится более пологой(снижается чувствительность) и загибается при более высоких концентрациях.

Вообще говоря, кислоту можно добавить в готовый раствор, но очень аккуратно, если ее перебухать можно испортить реактив окончательно. ОООчень приблизительно об избытке и недостатке кислоты можно судить по цвету реагента. Если он сильно отдает синей опалесценцией - кислоты недостаток, если наоборот сильно коричневый и синия опалесценция практически отсутствует кислоты избыток.

[Iskander]

получал одно и тоже число....это меня ввело в заблуждение я повторно просмотрел пердыдущие пробы т.е. с 1-ой по 6-ую и данные получил ментше чем были.. скажем...было 0,089 стало 0,077...0,096,,,стало 0,086...складывается впечатление что реагент ослаб.....какие есть мысли

Есть мысля, что выпал синий осадок белка с красителем и оптическая плотность просела до нуля. Сколько времени выдерживали? Потом, кумасси довольно сильно пачкает кювету, его потом надо спиртом вымывать.

[avor]

Есть мысля, что выпал синий осадок белка с красителем и оптическая плотность просела до нуля. Сколько времени выдерживали? Потом, кумасси довольно сильно пачкает кювету, его потом надо спиртом вымывать.

Ну по моему опыту чтобы начали выпадать хлопья нужно минут 30-45, там где белка много выпадает пораньше, там где мало - попозже.

А окраска кюветы, по идее, должна завышать, а не занижать результаты.

[Iskander]

Ну по моему опыту чтобы начали выпадать хлопья нужно минут 30-45, там где белка много выпадает пораньше, там где мало - попозже.

Точно. Но я не увидел, сколько времени выдерживали раствор. Может, час.

Если перепутать кюветы и ставить на нулевую линию грязную - то будет занижать.
Впрочем, это я уже в нездоровые извращения, недостойные аналитиков, полез.

[Georg Gasparyan]

Привет Коллеги!...все правильно осадок на стенках кюветы повысят ОП а не понизят...повторыл опыт сегодня в мм,кювете и в см.,кювете...та же картина...до 4 образца линейно возрастает начиная с 5 данные не меняются потом скачат ниже выше...что-то удивительно))))...ято касается кислоты...Ну остается из всего выше сказанного сделать все с НУЛЯ!..т.е.приготовить сногва кислоту...ну вообщем все с нуля,посмотрим что получится.

[Georg Gasparyan]

раствор смотреть начал спустя 5 минут длился просмотр минут 10 так что не в этом причина тем более что я фильтровал реагент и осадок и "пачканье" кюветы происходило на порядок меньше.

[OCULIS, NON MANIBUS]

Помочь советом не могу, но пожаловаться на метод тоже хочу. У меня с Брадфордом вечно какие-то проблемы - в биоматериале он работает очень нестабильно, хотя в литературе сплошь и рядом пишут что именно он должен применяться для этих целей
P.S. Давно перешла на Лоури-Хартри - довольна - слов нет

[Georg Gasparyan]

))))Вот и я начинаю опускать руки...предполагаю что мой куммаси "грязный" скорее всего тоже перейду на Лоури.

[avor]

Помочь советом не могу, но пожаловаться на метод тоже хочу. У меня с Брадфордом вечно какие-то проблемы - в биоматериале он работает очень нестабильно, хотя в литературе сплошь и рядом пишут что именно он должен применяться для этих целей
P.S. Давно перешла на Лоури-Хартри - довольна - слов нет

вы просто не умеете их готовить . Все такие окраски одинаково капризны, но проявляется это по разному, надо просто знать для чего применимы каждый метод, а для чего он не применим. Краткий обзор от меня приведен выше по ссылке при обсуждении топика FOX-7.

[Iskander]

Лоури даёт завышенные результаты при наличии в растворах углеводов, фенола или свободных аминокислот. Имейте это в виду.

[Georg Gasparyan]

Всем спасибо вроде что-то похожее на прямую получилось при помощи метанола вместо этанола и взял концентрацию G-250 в 2 раза больше...но все же БСА не особо годен для калибровки...

[Demiurg]

Здравствуйте уважаемые участники форума!

Хотелось бы и мне поделиться своими результатами определения белка по методу М. Брэдфорд, а заодно, по возможности, услышать Ваши оценки относительно полученных результатов и получить ответы на интересующие вопросы (собственно говоря, именно ради последних указанных целей и размещаю сей пост).
Использованная методика такова:
для приготовления рабочего реагента 10 мг Coomassie Brilliant blue G-250 растворял в 5 мл 95% этанола, добавлял 10 мл 85%-й фосфорной кислоты (при этом цвет раствора менялся с синего на примерно красноватый) и доводил дист. водой до 100 мл., а затем фильтровал.
В качестве стандарта использовал раствор БСА (Sigma, исходная концентрация - 1 мг/мл в 1х PBS (Phosphate buffered saline, pH 7,4); для разведения исходного концентрата также использовал 1х PBS; калибровочные точки - 0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 мкг/мл БСА в 1x PBS). Определение проводилось в 96-луночном планшете (SARSTEDT) на планшетном спектрофотометре (микропланшетный ридер) Tecan Safire 2 (длина волны измерения 595 нм, референсная длина волны 830 нм). В лунку вносилось 20 мкл пробы (стандарта) и 200 мкл реагента. Выдержка - 15 мин. Перед измерением плашка встряхивалась непосредственно в приборе. Все пробы анализировались в триплетах ( в 3-х повторностях).
Результаты:
1) в диапазоне от 0 до 200 мкг/мл зависимость оптической плотности от концентрации линейна
2) при концентрациях свыше 200 мкг/мл кривая загибается и вроде как выходит на плато (как и указывал уважаемый Avor в одном из предыдущих постов), точнее при конц. БСА от 200 мкг/мл наклон кривой становится гораздо более пологим (в районе 200 мкг/мл происходит резкий излом кривой)

Насколько правомерно использованная мною калибровочная кривая продолжена за пределы ("вниз") 25 мкг/мл я сказать затрудняюсь (встречал в некоторых источниках упоминания о том, что предельная чувствительность этого метода - 25 мкг/мл).
А что касается выбора стандарта (плох или хорош БСА), то, опять же, встречались упоминания о том, что в качестве стандарта для построения калибровок следует использовать именно тот белок, который планируется определять данным методом (скажем, интересует лизоцим, то и калибровку следует выполнять с использованием лизоцима). Но этот тезис, по-моему, весьма относителен, поскольку он хорош лишь в том случае, если в пробе отсутствуют другие белки, кроме искомого (определяемого). Метод, как известно, никакой изибирательностью ни к каким белкам не обладает. Кроме того, калибровка должна выполняться с использованием того же растворителя (той же среды), в котором находится и искомый белок (белки). Особенно критично наличие одинаковых концентраций детергентов и хелаторов металлов.

Помимо общих соображений, интересует следующий вопрос (возможно, не относящийся непосредственно к обсуждаемому вопросу): что такое референсная длина волны и зачем её нужно использовать?

Спасибо!

[avor]

Все нормуль у вас, правда, я обычно использую в таких форматах пробу 10мкл. И взвешивать 10мг кумаси - это сила!

Про референсную волну не знаю, никогда не пользовался возможно это волна, на которой раствор Брэдфорд имеет поглощение, независящие от концентрации белка. Используется для коррекции неодинаковости толщины слоя раствора в планшете.

[Demiurg]

Avor! Спасибо за ответ!

На самом деле (взвешивать 10 мг) я так "не извращался" - взвесил 100 мг и растворил в 50 мл этанола, а уже потом отбирал 5 мл этого спиртового раствора (про 10 мг - это из прописи методики приготовления реагента).
А вот если, как Вы пишите, брать 10 мкл пробы (стандарта), то и реагента надо брать 100 мкл?
И еще хотелось бы спросить. Вот после 200 мкг/мл (ну или начиная с 200) кривая выходит на плато (точнее, как уже писал, её наклон становится гораздо более пологим). Наверное, если продолжить кривую дальше (за 500 мкг/мл), она вообще станет параллельной оси X. Это я интересуюсь про то, а какова вообще предельная концентрация белка, которую по Брэдфорд можно корректно измерить?