Расчет и выражение активности (Са-АТФаза)

[Demiurg]

Здравствуйте!

Помогите, пожалуйста, разобраться в том, как рассчитывается и выражается активность фермента (конкретно - Са-АТФазы).
Активность определялась согласно с.359-360, а наработанный фосфат - согласно с.36-37.
При определении активности, в 1 мл инкубационной среды было внесено 15 мкг белка саркоплазматического ретикулума (37,5 мкл суспензии везикул)
Время инкубации - 10 мин.
Концентрация фосфата (по методу Ратбуна и Бетлах) - 700 мкг/мл (оптическое поглощение измерялось в 96-луночном планшете, в лунку вносилось 200 мкл реакционной смеси; из значения оптического поглощения опытной пробы вычиталось значение, полученное для холостой пробы (пробы, в которую не вносился белок)); калибровка для расчета концентрации неорганического фосфата делалась на основе KH2PO4, точки в диапазоне 25-550 мкг/мл KH2PO4).
Я не знаю, как на основе этих данных выразить активность в мкг Рн/мин на 100 мкг белка (ну или не обязательно в мин. или на 100 мкг) или вообще как-то по-другому.

Просьба "сильно не бить" за эти художества и незнание элементарных вещей.

[Vanya Ivanov]

Все не сложно.
Стройте график Y-скорость, X-конц белка, т.к. по одной точке - активность будет не очень точной,
описанная у вас методика подрозумевает, что у вас максимальная скорость.

v=[p1-p2]/[t2-t1] ; A =v*1mg/ M (мг/min на 1 мг ,белка)

v - скорость реакции изменение мг конц фосфата за 10 мин
р1 - начальная концентрация фосфата мг/мл
p2 - конечная концентрация мг/мл, через 10 мин ...
t2-t1 = 10 - время 10 мин
А - активность (скорость реакции на 1 мг белка)
M - количество белка-катализатора которое вы внесли в реакцию (без учета концентарции - 15 мкг - 0.015 мг), mg
(а вот скорость как раз зависит от концентарации белка, т.к. фосфат в избытке, и нужно бы построить график, првда ли у вас максимальная скорость фермент р-ции?)

Вроде как то так...

[Demiurg]

Спасибо за Ваш ответ!

Предположу, что расчет, который Вы привели, это расчет максимальной скорости фермента (Vmax), поскольку в практикуме Северина указано, что при таких условиях определения активности концентрация Са - примерно 10 мкМ, чего достаточно для полной активации фермента.
Опять же не скажу точно, но, вероятно, то, что нужно мне - это удельная активность фермента. Насколько тождественны эти понятия (Vmax и удельная активность) и можно ли на основе одного из них рассчитать другое, я и предполагать не берусь.
Меня интересует удельная активность при 37 гр., V max (если, конечно, эти понятия не одно и то же) и энергия активации для Са-АТФазы. В частности, в практикуме Северина (с.364-365) говорится о том, что при расчете энергии активации используются удельные активности.
Есть формула расчета в книге "Структура и функции мембран" (Рыбальченко) на с. 246-247, но там несколько другая методика( да и определяется не понятно что - никакого Са в инкубационной смеси нет, только Mg - может быть это определение активности Mg-АТФазы?). Хотелось бы разобраться.