Спектрофотометрические методы анализа белков

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Аватара пользователя
Осипов Веніамін
Сообщения: 143
Зарегистрирован: Пт ноя 14, 2008 2:02 pm

Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Осипов Веніамін » Пт ноя 05, 2010 6:31 pm

Уважаемые коллеги.
Скажите, может ли метод Бредфорда для количественного определения белка быть применен для определения количества пептидов?
Слышал, что в этом методе есть ограничение по нижнему краю молекулярной массы - около 3000 Да. Нужно проанализировать смесь, где присутствуют продукты ферментного (протеазного) гидролизата белка (либо растительного, либо бактериального).
Подскажите, какой спектрофотометрический метод наиболее подходит для решения этой задачи?

alexander_bk
Сообщения: 215
Зарегистрирован: Вс ноя 22, 2009 9:22 am

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение alexander_bk » Вс ноя 07, 2010 8:05 pm

Осипов Веніамін писал(а):Нужно проанализировать смесь, где присутствуют продукты ферментного (протеазного) гидролизата белка (либо растительного, либо бактериального).
Уточните.

Вам нужно проследить как расщепляются белки? Или вы просто хотите измерить некий общий белок до и после?
Если приведете подробности, то могу вам даже дать свои материалы по методам определения.

Аватара пользователя
Vanya Ivanov
Сообщения: 1767
Зарегистрирован: Пн авг 29, 2005 6:40 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Vanya Ivanov » Пн ноя 08, 2010 12:05 am

Если в кратце и просто, то для любых нативных белков:
концетрация белков и олигопептидов в диапазоне 0.5 - 5 мг/мл хорошо работает метод Лоури (с аммиакатом меди ... типа),
если белок высокомолекулярный и конц. низкая - используйте Бредфорда,

если олигопептиды и белки не нативные а биоинженерные - используйте метод УФ 280 нм, но калибруйтесь по сходной структуре (экстинции).
Есть множество модификаций, просто посмотрите практикум по общей или клинической биохимии. ничего сложного, все методы очень хорошо разработаны и повторяемы.

Аватара пользователя
Осипов Веніамін
Сообщения: 143
Зарегистрирован: Пт ноя 14, 2008 2:02 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Осипов Веніамін » Пн ноя 08, 2010 12:56 pm

Вот только непонятно, по чему калиброваться, если у нас - неидентифицируемая смесь пептидов, полученных в ходе обработки белкового субстрата грибной (или бактериальной) протеазой? Есть ли какие-то пептидные стандарты с известной концентрацией, как БСА?
Тут, конечно, понятно, что метод Брэдфорда мало подходит.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 12650
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение avor » Пн ноя 08, 2010 4:06 pm

Валите всю вашу смесь до аминокислот и нингидрином.

Аватара пользователя
Осипов Веніамін
Сообщения: 143
Зарегистрирован: Пт ноя 14, 2008 2:02 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Осипов Веніамін » Пн ноя 08, 2010 4:25 pm

Да вот сейчас читаю - больше склоняюсь к методу Лоури.

Аватара пользователя
nikkochem
Сообщения: 1401
Зарегистрирован: Чт ноя 26, 2009 12:47 pm
Контактная информация:

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение nikkochem » Пн ноя 08, 2010 4:48 pm

Так вам содержание белка в пробе? Делал по лоури, не понравилось. Потом перешел на кумасси G-250 (цифру могу попутать, но он один). Белок окрашивает реакционную смесь в синий цвет. Среда при определении должна быть кислая (мы использовали в качестве буфера фосфорную кислоту) так как в щелочной среде краситель окрашивается и без белка.
Уважающие себя физики и математики обходят стороной антинаучных художников рисущих молекулы и называющих себя химиками.

Аватара пользователя
Осипов Веніамін
Сообщения: 143
Зарегистрирован: Пт ноя 14, 2008 2:02 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Осипов Веніамін » Пн ноя 08, 2010 5:03 pm

Вот цитата из "The Bradford Method for Protein Quantitation" (Nicholas J. Kruger) в "The Protein Protocols Handbook" 2nd Edition:
" The dye does not bind to free arginine or lysine, or to peptides smaller than about 3000 Da"
Я был бы рад использовать этот метод, но мы имеем дело с пептидами, массой меньше 3 кДа.
Пока остановился на "Лоури" + процедура осаждения белка для отделения от интерферирующих веществ. Посмотрим, что получится.
Не понравится - будем другие пробовать. Самый конечный пункт - аминокислотный анализатор, но у нас его нет, - анализ только на заказ. Да и каждый раз напряжно будет так общий белок мерять.


Аватара пользователя
Vanya Ivanov
Сообщения: 1767
Зарегистрирован: Пн авг 29, 2005 6:40 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Vanya Ivanov » Пн ноя 08, 2010 6:06 pm

Я хочу повторить, что корректно использовать методы определения концентрации белка в зависимости от предпологаемой концентрации : высокой - лоури, низкой - бредфорд, не нативные смеси - 280 нм.
Кстати - я долгое время работал с белками плазмы крови - калибровался по BSA -бычий сывороточный албумин, а соседи с биоинженерными интерферонами - так они калибровались по 280 нм - со стандартными кровозаменителями (аминопептид, гидролизин и т.п.)

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 12650
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение avor » Пн ноя 08, 2010 6:59 pm

Осипов Веніамін писал(а): Самый конечный пункт - аминокислотный анализатор, но у нас его нет, - анализ только на заказ. Да и каждый раз напряжно будет так общий белок мерять.
Еще раз намекаю. Если вы гидролизнете весь белок в пробе а затем проведете реакцию с нингидрином то это практически идентично измерению колличества на АК -анализаторе, но без разделения АК. Дешево и в "домашних" условиях

--так они калибровались по 280 нм - со стандартными кровозаменителями (аминопептид, гидролизин и т.п.)

Это не совсем кровезаменитель скорее парэнтеральное питание. Но главное: А как они измеряли в нем концентрацию пептидов и аминокислот, ведь оно от партии к партии не постоянно, да и в паспорте ничего кроме общего азота не указано, а там ведь еще и соль есть. Ведь определенному поглощению аминопептида на 280 надо еще поставит определенную концентрацию "белка".

alexander_bk
Сообщения: 215
Зарегистрирован: Вс ноя 22, 2009 9:22 am

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение alexander_bk » Пн ноя 08, 2010 7:26 pm

Брэдфорд ни в коем случае. Кумасси адсорбируется определнными функциями белка и является скорей некоторой интегральной величиной. Лоури также не подойдет, так как определяет пептидную связь.

Ваш единственный выход нингидрин (будьте осторожны - это опасные для здоровья методы). Берите метод Руэмана в любой вариации (лично для нас наиболее оптимальной оказалась вариация с этиленгликолем и двухлористым оловом).

В целом исследование я бы провел так: сначала бы определил белок методом Брэдфорд (или Лоури: тут как лично у вас пойдет, т.к. Брэдфорд очень капризный). Это чтобы знать общее его количество до гидролиза. Но это если сумеете полученные результаты правильно прикрутить. Что касается стандарта, особо не заморачиваетесь, тут система настолько сложна, что нам надо хотя бы к чему-нибудь привязаться. Берете очищенный белок по структуре максимально близкой к вашему и калибруйте. На крайний случай альбумин тоже пойдет.
А можно как предлагают коллеги полностью гидролизнуть и наблюдать протеолиз с точки зрения неполноты гидролиза. Тут лишь бы было от чего отталкиваться.

Далее протеолиз бы смотрел уже методом Руэмана.

Еще имеет смысл вам попробовать электрофорез в ПААГ.
Последний раз редактировалось alexander_bk Пн ноя 08, 2010 7:33 pm, всего редактировалось 1 раз.

alexander_bk
Сообщения: 215
Зарегистрирован: Вс ноя 22, 2009 9:22 am

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение alexander_bk » Пн ноя 08, 2010 7:27 pm

ЗЫ: Прикрепляю мою методичку по методам анализа протеинов. Может пригодиться.
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

inview
Сообщения: 27
Зарегистрирован: Пн ноя 08, 2010 10:31 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение inview » Пн ноя 08, 2010 10:45 pm

Осипов Веніамін писал(а):Уважаемые коллеги.
Скажите, может ли метод Бредфорда для количественного определения белка быть применен для определения количества пептидов?
Слышал, что в этом методе есть ограничение по нижнему краю молекулярной массы - около 3000 Да. Нужно проанализировать смесь, где присутствуют продукты ферментного (протеазного) гидролизата белка (либо растительного, либо бактериального).
Подскажите, какой спектрофотометрический метод наиболее подходит для решения этой задачи?
Вениамин, каким ферментом Вы получаете гидролизат? Вы очищаете гидролизат от исходного белка и от фермента перед анализом? Сам белок, который Вы гидролизуете, как я понимаю, может быть самым разным? И какова концентрация исходного белка в смеси?

Вам тут пока насоветовали из "общих соображений", но не факт, что для конкретно Ваших условий это всё будет адекватным.

alexander_bk
Сообщения: 215
Зарегистрирован: Вс ноя 22, 2009 9:22 am

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение alexander_bk » Вт ноя 09, 2010 6:40 pm

Вы очищаете гидролизат от исходного белка и от фермента перед анализом
Не думаю, что содержание фермента там будет велико и не думаю, что исходный белок там останется. Автопротеолиз никто не мешает изучить отдельно, просто не добавляя белок, зачем очищать?

Аватара пользователя
Осипов Веніамін
Сообщения: 143
Зарегистрирован: Пт ноя 14, 2008 2:02 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Осипов Веніамін » Ср ноя 10, 2010 4:47 pm


Вениамин, каким ферментом Вы получаете гидролизат? Вы очищаете гидролизат от исходного белка и от фермента перед анализом? Сам белок, который Вы гидролизуете, как я понимаю, может быть самым разным? И какова концентрация исходного белка в смеси?

Фермент для гидролиза - бактериальная щелочная протеаза. Сама процедура такова: в буфере проходит гидролиз либо растительного либо бактериального белка. Далее смесь отстаивается. Надосадочная жидкость отделяется от осадка. Кислотой высаждается негидролизованный белок. Супернатант отделяется от осадка и переносится в конечную смесь, рН которой - около 2-2,5.
...В общем получается, что надо добиться общего содержания, преимущественно, пептидов и аминокислот в конечной смеси - около 10 мг/л. Выходит, что по сути надо анализировать дважды: первый раз - "концентрат" пептидов, второй - конечную смесь. Разные концентрации, конечно. В первом случае все будет зависеть от особенностей технологического процесса. Для второго случая параметры измеряемой смеси известны. Сейчас важен анализ на конечной стадии.
Согласен, конечно, что из спектральных наиболее подходят методы с полным гидролизом белка и последующим количественным определением общего содержания аминокислот. Сейчас только начинаю прорабатывать эту тему серьезно.
Спасибо за помощь

Аватара пользователя
Осипов Веніамін
Сообщения: 143
Зарегистрирован: Пт ноя 14, 2008 2:02 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Осипов Веніамін » Ср ноя 10, 2010 4:54 pm

Да, содержанием протеазы в конечной смеси можно пренебречь: для гидролиза ее берут мало. Да и сденатурирует она в кислой среде.

inview
Сообщения: 27
Зарегистрирован: Пн ноя 08, 2010 10:31 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение inview » Чт ноя 11, 2010 8:19 am

alexander_bk писал(а):
Вы очищаете гидролизат от исходного белка и от фермента перед анализом
Не думаю, что содержание фермента там будет велико и не думаю, что исходный белок там останется. Автопротеолиз никто не мешает изучить отдельно, просто не добавляя белок, зачем очищать?
Автопротеолиз тут ни при чем, а ферментативный гидролиз не всегда (зависит от условий) протекает полностью. Точнее - совсем полностью он не протекает никогда.

inview
Сообщения: 27
Зарегистрирован: Пн ноя 08, 2010 10:31 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение inview » Чт ноя 11, 2010 8:25 am

Осипов Веніамін писал(а): Фермент для гидролиза - бактериальная щелочная протеаза. Сама процедура такова: в буфере проходит гидролиз либо растительного либо бактериального белка. Далее смесь отстаивается. Надосадочная жидкость отделяется от осадка. Кислотой высаждается негидролизованный белок. Супернатант отделяется от осадка и переносится в конечную смесь, рН которой - около 2-2,5.
...В общем получается, что надо добиться общего содержания, преимущественно, пептидов и аминокислот в конечной смеси - около 10 мг/л. Выходит, что по сути надо анализировать дважды: первый раз - "концентрат" пептидов, второй - конечную смесь. Разные концентрации, конечно. В первом случае все будет зависеть от особенностей технологического процесса. Для второго случая параметры измеряемой смеси известны. Сейчас важен анализ на конечной стадии.
Согласен, конечно, что из спектральных наиболее подходят методы с полным гидролизом белка и последующим количественным определением общего содержания аминокислот. Сейчас только начинаю прорабатывать эту тему серьезно.
Спасибо за помощь
Хорошо, понятно, я сейчас на занятиях, к завтра постараюсь ответить. Что касается полного гидролиза - это тоже не совсем идеал. По крайней мере, чтобы избежать ошибки, связанной с составом белка, Вам придется анализировать минимум два вида полног гидролизата - кислотный (лучшие результаты будут, если я правильно помню, при гидролизе метансульфоновой кислотой) и щелочной. Потому что в каждом из вариантов полного гидролиза некоторые аминокислоты разрушаются полностью или частично, а значит - Вы их не сможете обнаружить или получите заниженные результаты

Аватара пользователя
Осипов Веніамін
Сообщения: 143
Зарегистрирован: Пт ноя 14, 2008 2:02 pm

Re: Спектрофотометрические методы анализа белков

Сообщение Осипов Веніамін » Чт ноя 11, 2010 5:12 pm

Мне все больше нравится метод с использованием замеров в дальней и ближней УФ-области. Интереснее - первое. Метод мало зависит от состава буфера и рН смеси. образец не подвергается специальной обработке реактивами. Правда, для разведения используется простой буфер с рН около 7. Метод показывает +/- устойчивые и адекватные результаты на разных белках. Плюс еще в уравнения коррекция поглощения в УФ-области нуклеотидами и нуклеиновыми кислотами. Но, по-видимому все эти трудности можно преодолеть, введя контроль по бланку с соответствующей степенью разведения, содержащему все компоненты исследуемой смеси кроме белковой смеси. Думаю, так получится.
Коллеги, спасибо за помощь и участие в дискуссии.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 7 гостей