Буферы для промывки аффин.гелей

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
catann
Сообщения: 29
Зарегистрирован: Вт ноя 15, 2005 10:07 am

Буферы для промывки аффин.гелей

Сообщение catann » Чт май 18, 2006 3:43 pm

Поделитесь опытом - кто каким буфером промывает аффинные гели (на основе сефарозы). А то у меня после 6М мочевины он приобрёл интенсивную серую окраску

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 12650
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Буферы для промывки аффин.гелей

Сообщение avor » Чт май 18, 2006 6:21 pm

catann писал(а):Поделитесь опытом - кто каким буфером промывает аффинные гели (на основе сефарозы). А то у меня после 6М мочевины он приобрёл интенсивную серую окраску
Дык мочевину то надо чистенькую брать.
ЗМ роданид, 6М гуанидин гидрохлорид, 4-6М гунидин тиоцианат - это хаотропы. Они кстати должны частично разрушать несшитую(не CL) сефарозу.

А так еще кислотой при рН 2-4,(цитратный или глициновые буфера)
Можно рН 10-11, но для BrCN это плохо. А можно свободным лигандом если вам его нежалко.

Химимагний
Сообщения: 6
Зарегистрирован: Пт май 19, 2006 5:01 pm

Сообщение Химимагний » Пт май 19, 2006 5:16 pm

После того, как Вы пропустили через сорбент раствор с искомым веществом, потом промыли от неспецифики, потом сняли искомое вещество сильным хаотропом (мочевина, щелочь, кислота) на колонке, как правило, ничего не остается. И потому мыть ее надо исходным буфером, т.е. PBS, TBS и т.п., чтобы подготовыть для следующего цикла ил консервации.
А если Вы хотите спросить, чем снимать искомое в-во, ну дык и спрашивайте "как смыть с колонки связанный антителами белок?" Это например.
Про это avor все правильно написал. У меня самые приятные ощущения от снятия белка с МАТ карбонатом, pH 10,5. Главное, в емкость на приеме надо добавить для нейтрализации 0,5 М фосфата калия с pH 4-5, чтобы не мучать белок.
Но очень многое зависит от того, с чем конкретно Вы имеете дело.

catann
Сообщения: 29
Зарегистрирован: Вт ноя 15, 2005 10:07 am

Сообщение catann » Пн май 22, 2006 2:09 pm

всем спасибо за внимание. Поясняю:
- мочевину я беру чистую - такую же, какой промывалась DEAE- Seph колонка - и ничего с гелем не происходило - цвет не менял.
- антител у меня на колонке никаких нет, а есть субстрат и поэтому белок - фермент держится не так хорошо, чтобы его мочевиной или щёлочью смывать. И проблема у меня в том, чтобы смыть всё что осталось.
- лиганд присоединяли к эпоксиактивированной колонке и может быть такая связь более чувствительна ко всяким "сильным хаотропам" - вот в чём мой вопрос.

Химимагний
Сообщения: 6
Зарегистрирован: Пт май 19, 2006 5:01 pm

Сообщение Химимагний » Пн май 22, 2006 3:53 pm

фермент держится не так хорошо, чтобы его мочевиной или щёлочью смывать. И проблема у меня в том, чтобы смыть всё что осталось.
Суть аффинной хроматографии в том и состоит, что лучше всего за колонку должен цепляться целевой белок. Т.е., нагружаете колонку, пропуская смесь, потом аккуратно смываете неспецифику так, чтобы не снять свой фермент, а потом смываете фермент, как - Вы знаете сами. После этого на колонке ничего не остается.
Так вот, если ДО СНЯТИЯ фермента надо отмыть колонку, то сначала мойте тем же буфером (контроль качества отмывки обычно по поглощению при 280 нм), потом в буфер можно добавить соль (NaCl, KCl) до 1М. Лучше градиентом или ступенчато, все время отслеживая общее поглощение (отмывку от неспецифики) и ферментативную активность в растворе, чтобы не прозевать целевой продукт.
Вид колонки мог ухудшиться в результате того, что Вы не полностью заблокировали активные группы, и при нанесении образца что-то из него прореагировало и иммобилизовалось на колонке. Как правило, для использования по назначению это никаких проблем не создает.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 3 гостя