Буферы для промывки аффин.гелей
Буферы для промывки аффин.гелей
Поделитесь опытом - кто каким буфером промывает аффинные гели (на основе сефарозы). А то у меня после 6М мочевины он приобрёл интенсивную серую окраску
Re: Буферы для промывки аффин.гелей
Дык мочевину то надо чистенькую брать.catann писал(а):Поделитесь опытом - кто каким буфером промывает аффинные гели (на основе сефарозы). А то у меня после 6М мочевины он приобрёл интенсивную серую окраску
ЗМ роданид, 6М гуанидин гидрохлорид, 4-6М гунидин тиоцианат - это хаотропы. Они кстати должны частично разрушать несшитую(не CL) сефарозу.
А так еще кислотой при рН 2-4,(цитратный или глициновые буфера)
Можно рН 10-11, но для BrCN это плохо. А можно свободным лигандом если вам его нежалко.
-
- Сообщения: 6
- Зарегистрирован: Пт май 19, 2006 5:01 pm
После того, как Вы пропустили через сорбент раствор с искомым веществом, потом промыли от неспецифики, потом сняли искомое вещество сильным хаотропом (мочевина, щелочь, кислота) на колонке, как правило, ничего не остается. И потому мыть ее надо исходным буфером, т.е. PBS, TBS и т.п., чтобы подготовыть для следующего цикла ил консервации.
А если Вы хотите спросить, чем снимать искомое в-во, ну дык и спрашивайте "как смыть с колонки связанный антителами белок?" Это например.
Про это avor все правильно написал. У меня самые приятные ощущения от снятия белка с МАТ карбонатом, pH 10,5. Главное, в емкость на приеме надо добавить для нейтрализации 0,5 М фосфата калия с pH 4-5, чтобы не мучать белок.
Но очень многое зависит от того, с чем конкретно Вы имеете дело.
А если Вы хотите спросить, чем снимать искомое в-во, ну дык и спрашивайте "как смыть с колонки связанный антителами белок?" Это например.
Про это avor все правильно написал. У меня самые приятные ощущения от снятия белка с МАТ карбонатом, pH 10,5. Главное, в емкость на приеме надо добавить для нейтрализации 0,5 М фосфата калия с pH 4-5, чтобы не мучать белок.
Но очень многое зависит от того, с чем конкретно Вы имеете дело.
всем спасибо за внимание. Поясняю:
- мочевину я беру чистую - такую же, какой промывалась DEAE- Seph колонка - и ничего с гелем не происходило - цвет не менял.
- антител у меня на колонке никаких нет, а есть субстрат и поэтому белок - фермент держится не так хорошо, чтобы его мочевиной или щёлочью смывать. И проблема у меня в том, чтобы смыть всё что осталось.
- лиганд присоединяли к эпоксиактивированной колонке и может быть такая связь более чувствительна ко всяким "сильным хаотропам" - вот в чём мой вопрос.
- мочевину я беру чистую - такую же, какой промывалась DEAE- Seph колонка - и ничего с гелем не происходило - цвет не менял.
- антител у меня на колонке никаких нет, а есть субстрат и поэтому белок - фермент держится не так хорошо, чтобы его мочевиной или щёлочью смывать. И проблема у меня в том, чтобы смыть всё что осталось.
- лиганд присоединяли к эпоксиактивированной колонке и может быть такая связь более чувствительна ко всяким "сильным хаотропам" - вот в чём мой вопрос.
-
- Сообщения: 6
- Зарегистрирован: Пт май 19, 2006 5:01 pm
Суть аффинной хроматографии в том и состоит, что лучше всего за колонку должен цепляться целевой белок. Т.е., нагружаете колонку, пропуская смесь, потом аккуратно смываете неспецифику так, чтобы не снять свой фермент, а потом смываете фермент, как - Вы знаете сами. После этого на колонке ничего не остается.фермент держится не так хорошо, чтобы его мочевиной или щёлочью смывать. И проблема у меня в том, чтобы смыть всё что осталось.
Так вот, если ДО СНЯТИЯ фермента надо отмыть колонку, то сначала мойте тем же буфером (контроль качества отмывки обычно по поглощению при 280 нм), потом в буфер можно добавить соль (NaCl, KCl) до 1М. Лучше градиентом или ступенчато, все время отслеживая общее поглощение (отмывку от неспецифики) и ферментативную активность в растворе, чтобы не прозевать целевой продукт.
Вид колонки мог ухудшиться в результате того, что Вы не полностью заблокировали активные группы, и при нанесении образца что-то из него прореагировало и иммобилизовалось на колонке. Как правило, для использования по назначению это никаких проблем не создает.
Кто сейчас на конференции
Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 3 гостя