окисление белка без изменения молекулярной массы

[MNB]

Коллеги, у нас получился странный результат: белковую пробу обработали надмуравьиной кислотой, в результате чего электрофоретическая подвижность в ПААГ (5% уксусная кислота) значительно упала (что может свидетельствовать об окислении остатков цистеина/цистина до цистеиновой кислоты), а молекулярная масса сохранилась неизменной с точностью до Дальтона (ESI/TOF масс-спектрометрия).

Сталкивался ли кто-нибудь с чем-нибудь подобным и как это можно объяснить?

[Upstream]

Под Ваше описание подходит SS-димер. Просто Вы не видите его молекулярного иона [М+H]⁺, а наблюдаете двухзарядник [2М-2+2H]²⁺, которые действительно имеют близкие величины M/z: (2М-2+2H)/2 ~ (M+H)/1.
В этом можно с лёгкостью убедится, если попросить сместить рамку считывания масс. Обычно её ширина в ESI-MS - 2000 Да. Двухзарядник однозначно идентифицируется ещё и по тонкой структуре моноизотопного кластера при разрешении не хуже 0.5 Да.
Upd. Sorry: в первой строчке было два идентичных выражения для одно и двухзарядного ионов.

[Cherep]

+1, что ошибка может быть в интерпритации масс-спектра или настройке прибора... но

При ионизации ESI белки обычно летят в виде частиц с множеством зарядов (как было написано в мануале одного такого прибора). И целый забор пиков типа [M+10H⁺]¹⁰⁺\10, [M+11H⁺]¹¹⁺\11, [M+12H⁺]¹²⁺\12 - не редкость. Для того, чтобы получить реальный M, используется специальная математическая процедура с мудрёным названием deconvolution. Какие при этом могут быть ошибки - ХЕЗ.

И ещё, у топикстартера ESI TOF. В масс-анализаторе TOF предел m/z хоть 100 000, а то и больше (реальный предел задаётся средсвами программного обеспечения). То есть теоретически можно было бы наблюдать немного [M+2H⁺]²⁺\2, а то и [M+1H⁺]¹⁺

Также, если диапазон m\z выставлен широко, то тогда можно (к примеру) не отличить разницу между изотоптными пиками в 1 amu и 0.5 amu - то есть перепутать мономер с одним зарядом и димер с двумя зарядами (если такие пики вообще есть).

[Upstream]

Теоретически всё верно, Слава. Однако весьма популярный в наших краях ThermoFinnigan LCQDecaXP, с которым связан мой личный опыт, по словам оператора, имеет именно немассштабируемую рамку в 2000. Хотя ограничений по максимальной массе у него нет, мне ещё ни разу не удалось сподвигнуть этого деятеля её отодвинуть от нуля. Якобы придётся дважды перекалибровывать прибор. Ему больше нравится выкапливать кластеры в узком диапазоне масс (картинка во вложении).
Деконволюцию приходится делать "вручную". Я просто нарисовал в EXCEL табличку, считающую многозарядные, натриевые и калиевые M/z после ввода теоретической мол. массы.

[Cherep]

Но ведь в ThermoFinnigan LCQ Deca XP масс сепаратор - ионная ловушка (ion trap): про возможность вылазить за m\z > 2000 я ничО не помню из мануалов, хотя Х его З. А в том приборе масс-сепаратор времяпролётный (time of flight) - это иная конструкция, там диапазон менять проще...

[MNB]

Upstream, Cherep, спасибо, что откликнулись.

Хочу уточнить:
На масс-спектре (который получился не очень хорошего качества) обнаружились два пика, соответствующих 7- и 8-зарядным ионам, уровень заряда рассчитан по формуле (m/z₂-1)/(m/z₂-m/z₁). Пиков с меньшим зарядом (большим m/z) не было видно.
В применявшейся электрофоретической системе наблюдавшийся существенный сдвиг в подвижности скорее всего свидетельствует об уменьшении положительного заряда молекулы. Олигомеризация тоже могла бы вызвать такой сдвиг, но почему тогда олигомеры распались при масс-спектрометрии?

Прошу прощения, если был недостаточно точен в первом посте.

[MNB]

Upstream, Cherep, спасибо, что откликнулись.

Хочу уточнить:
На масс-спектре (который получился не очень хорошего качества) обнаружились два пика, соответствующих 7- и 8-зарядным ионам, уровень заряда рассчитан по формуле (m/z₂-1)/(m/z₂-m/z₁). Пиков с меньшим зарядом (большим m/z) не было видно.
В применявшейся электрофоретической системе наблюдавшийся существенный сдвиг в подвижности скорее всего свидетельствует об уменьшении положительного заряда молекулы. Олигомеризация тоже могла бы вызвать такой сдвиг, но почему тогда олигомеры распались при масс-спектрометрии?

Прошу прощения, если был недостаточно точен в первом посте.

[Cherep]

Раз масс-спектр плохого качества, то переснять надо. Пока есть гипотеза, что в интерпритации спектра может быть глюк.

[MNB]

Переснять, конечно, неплохо бы. Вот только это делалось за мои личные деньги, поэтому хотелось бы избежать многочисленных повторов, к тому же по ряду причин это в любом случае невозможно в ближайшее время.

Глюк в интерпретации, возможно, имеется, но какова может быть его природа, если две пробы дают спектры с двумя пиками в одних и тех же местах? Я, скорее, думал о возможности каких-то непредусмотренных химических превращений за время хранения лиофилизированной пробы или в процессе ионизации, но ничего правдоподобного в голову не пришло.

[Upstream]

На масс-спектре (который получился не очень хорошего качества) обнаружились два пика, соответствующих 7- и 8-зарядным ионам, уровень заряда рассчитан по формуле (m/z2-1)/(m/z2-m/z1). Пиков с меньшим зарядом (большим m/z) не было видно.
В применявшейся электрофоретической системе наблюдавшийся существенный сдвиг в подвижности скорее всего свидетельствует об уменьшении положительного заряда молекулы. Олигомеризация тоже могла бы вызвать такой сдвиг, но почему тогда олигомеры распались при масс-спектрометрии?

ТОЛЬКО 2 кластера и в исходном и после окисления? Такое возможно лишь при выпадении всех остальных за рамку сканирования масс. В необрезанном виде Вы должны видеть колоколообразное распределение интенсивностей всех кластеров, попавших в область сканирования. А каков порядок величин наблюдаемых m/z?
Речь шла не о распаде димера, а о математической близости (m+z)/z для мономера и SS-димера - (2М-2+2z)/2z, что делает невозможным чёткое установление мол массы при плохом разрешении, но это справедливо лишь для одно и двухзарядников.
Чтобы рассеить все сомнения обработайте аликвотку окисленного белка DTT и прогоните 3 образца на форезе параллельно. И полистайте тома Methods in Enzymology по Biothiols.

[nikkochem]

Если до и после обработки надмуравинкой на при электрофорезе наблюдается одна полоска, то с высокой вероятностью у вас один пептид. Значит секвенатор вам в помощь

[MNB]

ТОЛЬКО 2 кластера и в исходном и после окисления? Такое возможно лишь при выпадении всех остальных за рамку сканирования масс. В необрезанном виде Вы должны видеть колоколообразное распределение интенсивностей всех кластеров, попавших в область сканирования. А каков порядок величин наблюдаемых m/z?

Да, только по два. Нативная - 1129,76 и 1290,95, окисленная - 1129,61 и 1290,93

[MNB]

Чтобы рассеить все сомнения обработайте аликвотку окисленного белка DTT и прогоните 3 образца на форезе параллельно. И полистайте тома Methods in Enzymology по Biothiols.

Если до и после обработки надмуравинкой на при электрофорезе наблюдается одна полоска, то с высокой вероятностью у вас один пептид. Значит секвенатор вам в помощь

Спасибо за советы, буду думать.

[Cherep]

Да, только по два. Нативная - 1129,76 и 1290,95, окисленная - 1129,61 и 1290,93

Ну так чтобы увидеть разницу, нужно лучшее разрешение!

Теоретически TOF это позволяет - калибруют узкий участок с точностью хотябы до третьего знака. Это если софт позволяет.

[MNB]

Да, только по два. Нативная - 1129,76 и 1290,95, окисленная - 1129,61 и 1290,93

Ну так чтобы увидеть разницу, нужно лучшее разрешение!

Теоретически TOF это позволяет - калибруют узкий участок с точностью хотябы до третьего знака. Это если софт позволяет.

Наверное, Вы правы, но я полагаю, что нам большая точночть и не нужна. Здесь по всем 4 значениям получается 9029-9030 Да, в то время как при окислении надмуравьиной кислотой к каждому цистеиновому или полуцистиновому остатку присоединяется по 3 кислорода - именно такой реакцией (образованием цистеиновой кислоты) можно объяснить уменьшение заряда молекулы. Проблема в том, что заряд именно уменьшается, то есть переходы типа Fe²⁺ Fe³⁺, не детектируемые на масс-спектрометре, в качестве объяснения не подходят.

[avor]

А может у вас проблемы с форезом. Может вам поставить изоэлектрофокусирование для контроля, а также попробовать потитровать SH группы может реакция-то и не прошла, а случилось что-то другое, например, изменилась конформация белка.

[MNB]

А может у вас проблемы с форезом. Может вам поставить изоэлектрофокусирование для контроля, а также попробовать потитровать SH группы может реакция-то и не прошла, а случилось что-то другое, например, изменилась конформация белка.

Спасибо, советы разумные. Про Эллмана я думал, про ИЭФ в голову не приходило.