иммобилизация белка

[polypyrrole]

Ув. биохимики, помогите, пожалуйста в решении следующей проблемы. Пробуем привязать белок (avidin FITC) к поверхности золота, модифицированного цистамином (cystamine), с помощью глутарового альдегида (glutaraldehyde). Судя по литературным данным такое привязывание проходит достаточно легко через образование иминной связи. Но, к сожалению, никак не удается это осуществить. Пробовали разные протоколы описанные в литературе (меняли концетрацию альдегида от 2.5 % до 10 %, и время реакции от 1часа до 24 ч), а белок не привязывается (проверяем по наличию свечения на флуоресцентном микроскопе). В чем может быть причина?

[avor]

Ув. биохимики, помогите, пожалуйста в решении следующей проблемы. Пробуем привязать белок (avidin FITC) к поверхности золота, модифицированного цистамином (cystamine), с помощью глутарового альдегида (glutaraldehyde). Судя по литературным данным такое привязывание проходит достаточно легко через образование иминной связи. Но, к сожалению, никак не удается это осуществить. Пробовали разные протоколы описанные в литературе (меняли концетрацию альдегида от 2.5 % до 10 %, и время реакции от 1часа до 24 ч), а белок не привязывается (проверяем по наличию свечения на флуоресцентном микроскопе). В чем может быть причина?

А цистамин сел?
К тому же белок просто так может сесть на золото вообще без химии, но связь будет не ковалентная, а адсорбционная.
Могу только посоветовать вместо глютара использовать бисимидаты или биссукцинимдные эфиры. Еще можно купить, я даже могу немного выслать сукцинимидного эфира биотина его надо провзаимодействовать с цистамином в карбонатном буфере(рН-9.5), а потом на него(на биотин) авидин будет прыгать мама не горюй. Условие предоставления биотина соавторство. Кстати на коллоидное золото белок просто так садится без ковалентности.

[dan14444]

Амин на амин? Нэхарашо. Для кусков нэхарашо, для коллоидов полный абзац вааще...
Вяжите на карбоксил али ещё как несимметрично.

Амины белка на золото, кстати, завяжутся не особо хуже серы. Но если савсэм прочно нада - тиолируйте белок. Биотин тиолированный тоже можно, но будет хуже. Сушшественно.

Кстати, на голом золоте флуоресцин благополучно потушится.

[Polychemist]

В случае глутара невоспроизводимость методик часто связана с его грязнотой - примесью полимера, который все забивает и опошляет. Поэтому если у Вас не супер-пупер реагент для эл. микроскопии и т.п. - переконденсируйте в вакууме.

[polypyrrole]

Спасибо за ответы. Наличие цистамина на золоте проверяли электрохимич. десорбцией в КОН, пик десорбции наблюдается. Что касается биссукцинимдных эфиров, то мы рассматривали вариант с использованием такого линкера как Dithiobis[succinimidyl propionate), поскольку нам нужна "cleavable bond", чтобы белок потом можно было удалить. еще не делали, нужно покупать DSP. Пробовали привязывать белок через дитиогликолевую к-ту с активирование карбоксильных групп в EDC/NHS, но тоже ничего не получилось.
Действительно может быть проблема в глутаровом альдегиде, он у нас не для микроскопии.

[avor]

Действительно может быть проблема в глутаровом альдегиде, он у нас не для микроскопии.

Очень может быть.

--Кстати, на голом золоте флуоресцин благополучно потушится.
Это почему это?
И к тому же он не на голом золоте, а на белке

[dan14444]

Почему - расписывать долго, но он таки потушится. Белок - да, то, что с противоположной стороны от золота - как-то будет светится, хотя вероятно тушение и туда отчасти дотянется - слишком авидин маленький. В идеале спейсер нужен нанометров от 2-3 - там и усиление может случиться, однако... Я золота в 10нм силику закатывал, а на неё уже шил краску.

[avor]

Почему - расписывать долго, но он таки потушится. Белок - да, то, что с противоположной стороны от золота - как-то будет светится, хотя вероятно тушение и туда отчасти дотянется - слишком авидин маленький. В идеале спейсер нужен нанометров от 2-3 - там и усиление может случиться, однако... Я золота в 10нм силику закатывал, а на неё уже шил краску.

-В идеале спейсер нужен нанометров от 2-3 - там и усиление может случиться

Дык, ведь, вот оно!: 4-6нм
Due to the size of avidin (56x50x40 A°
[18]) [18] L. Pugliese, A. Coda, M. Malcovati, M. Bolognesi, J. Mol. Biol.
231 (1993) 698.
http://people.web.psi.ch/padeste/FcSAv1.pdf

-Почему - расписывать долго, но он таки потушится.

Звучит так как-будто: "Этого не может быть, потому что я так сказал".

Просим, просим. Расскажите уж, хоть и долго - мы послушаем, можно частями не за один день.

[dan14444]

О, так он больше, чем я думал... Тады часть метки будет почти нормально светится.

Почему гасится - тупая безизлучательная релаксация, падает как 12 степень расстояния в теории, по моему... Вбейте fluorescence quenching gold - и всё будет, например Nano Lett., 2006, 6 (3), pp 530–536.

Плюс может быть и усиление на плазмонах - на золоте правда вряд ли, а на серебре - вполне. Там вроде 6 степень, максимум в районе 10 нм у меня получался...