Ферментативный гидролиз пектиназой

[Ra]

Уважаемые коллеги, помогите, пожалуйста, разобраться с ферментативным гидролизом.
Надо получить агликон, у которого по ОН- и COOH- группам привешены глюкозные остатки из соответствующего гликозида. По литературным данным для этого используют коммерческую пектиназу (Pectinol 50 L), с выходом 77% подробной методики не приводят.
Pectinol 50 L не нашли купили Pectinase (from Aspergillus niger) 1 units/mg (порошок).

Впервые сталкиваюсь с ферментами, возникли некоторые вопросы. Можно ли рассчитать количество фермента на гидролиз гликозида, учитывая его активность? Может быть, кто-нибудь имел дело с препаратом Pectinol 50 L, какова там примерно активность пектиназы?

[avor]

http://www.worthington-biochem.com/PASE/assay.html

И рядом посмотрите.

Pectinol 50 L как я понял больше не производится а его производитель почил в бозе.

[Ra]

Спасибо за информацию.
Могу ли я взять навеску пектиназы опираясь на такое рассуждение: в 1 мг нашего препарата пектиназы (1 units/mg), содержание активного фермента хватает на расщепление 10-3 молей субстрата, а т.к. в субстрате 3 остатка глюкозы надо взять 3-кратный избыток или ферменты можно использовать в каталитических количествах?

[Joni-Fantazi]

Кусочек из будущей статьи жены:

Ферментативный гидролиз пектиназой. Фракции водорастворимых пектинов AS1 И AS2 (июль, по 50 мг) растворяли в 5.0 мл воды, добавляли водный раствор пектиназы (2.0 мг, Ferak, Berlin). Смеси инкубировали при 25ºС в течении 40 мин. Расщепление углеводной це-пи пектиназой контролировали по увеличению количества восстанавливающих сахаров по методу Нельсона и Самоджи [52]. Пектиназу дезактивировали кипячением на водяной бане в течение 10 мин. при 100ºС. Скоагулированный белок, выпавший в осадок удаляли центрифу-гированием. Полученный раствор концентрировали и осаждали 4-х кратным объемом 96%-ного этанола. Выпавший осадок отделяли центрифугированием и промывали метанолом до отсутствия моносахаридов, растворяли в воде и лиофилизовали. Спиртовой супернатант концентрировали и анализировали методом БХ.

52. Hodge J.E., Hofreiter B.T. Determination of reducing sugars and carbohydrates // Methods in carbohydrate chemistry / Eds. R.L. Whistler, M.L. Wolfrom, J.N. BeMiller, F. Shafizadeh - New York: Acad. Press., 1962. - P. 380-394.

Еще почитать (там аналогичная методика): 1) Бушнева О.А., Оводова Р.Г., Мишарина Е.А. Силенаны – полисахариды смолевки обык-новенной (Silene vulgaris) // Химия раст. сырья. – 1999. – № 1. – С. 27-32.
2) Выделение и предварительное исследование строения полисахаридов из смолевки обык-новенной Silene vulgaris / Р.Г. Оводова, О.А. Бушнева, А.С. Шашков и др. Биоорган. хи-мия. – 2000. – Т. 26. – С. 686-692.
Это то, что попалось сразу. По литературе в статьях и фамилиям авторов можете ещё поискать.

Спасибо за информацию.
Могу ли я взять навеску пектиназы опираясь на такое рассуждение: в 1 мг нашего препарата пектиназы (1 units/mg), содержание активного фермента хватает на расщепление 10-3 молей субстрата, а т.к. в субстрате 3 остатка глюкозы надо взять 3-кратный избыток или ферменты можно использовать в каталитических количествах?

Активность фермента (для данного случая) означает: 1 мг фермента за время t отщепляет х мг моносахарида. Больше время - больше отщепится. И да, фермент - это "катализатор".

Моё мнение - подбирать соотношение (ваш субстат)/фермент экспериментально, также подбирать время.
Не забудьте про рН и температуру раствора - ферменты довольно капризны к этим показателям.

[Ra]

Joni-Fantazi, спасибо за советы!