вопрос про ДНК

[Бухалыч]

Вопрос, собственно, такой:
Как пришпандорить что-либо к одному из концов ДНК (любому)?
Планируется пришпандоривать кусок дендримера; хотелось бы, чтоб он не отваливался при электрофорезе (в а.г.)

[avor]

Вопрос, собственно, такой:
Как пришпандорить что-либо к одному из концов ДНК (любому)?
Планируется пришпандоривать кусок дендримера; хотелось бы, чтоб он не отваливался при электрофорезе (в а.г.)

Дендример на сленге(олиг) олигонуклеотид? Я правильно понял.
Ферментативно Т4 лигаза
Рекомендую:
http://russia.sibenzyme.com/info195.php

буфер по моему с ней идет, там важный и лабильный компонет АТФ. Все хранится на -20.

Побочная реакция сшивка фрагментов и олигов отсюда мораль нужно подбирать концентрации и их соотношения.

[Бухалыч]

Дендример на сленге(олиг) олигонуклеотид?

Не, не совсем. Короче, надо как-то стерически заблокировать ДНК с одного конца (предполагалась пришивка дендримера с диаметром около 10 нм, т.е. раза в 4 толще ДНК). Чтобы ДНК с макроциклом заротаксанивалась с другого конца.

[avor]

заротаксанивалась с другого конца.

Переведите не понял. да и про дендример чегож это такое дендример. Ну "толстое", а что "толстое".

[Бухалыч]

Я имел ввиду, что хотелось бы заставить некий макроцикл надеваться на ДНК, типа так:

DNAcomplex.png

Причём только с одного конца, для чего предполагалось другой конец закрыть неким дендримером

[avor]

Я имел ввиду, что хотелось бы заставить некий макроцикл надеваться на ДНК, типа так:

DNAcomplex.png

Причём только с одного конца, для чего предполагалось другой конец закрыть неким дендримером

можно использовать функционализованный олигонуклеотид Например с аминоалил группой на оснавании. Если олиг будет комплементарен концевой последовательности то ДНК плимераза после плавленния и гибридизации олига с концом одной из цепей может достроить вторую цепь до конца(вроде полимеразной цепной реакции) . После чего на функциональный амин пришить функциональный карбоксил от дендримера по аналогии с пептидным синтезом(лучше правда использоват на дендример активированный гидроксисукцинимидный эфир карбоксила).

Олиг может быть адаптерным. Те его можно просто пришить лигазой к одному из концов ДНК функцианализованный олиг, а к другому обычный, после сделать некоторе количество циклов ПЦР и вы получете комплект ДНК на одном из концов, которой будет функцианолизован первичным амином.

[Бухалыч]

можно использовать функционализованный олигонуклеотид Например с аминоалил группой на оснавании. Если олиг будет комплементарен концевой последовательности то ДНК плимераза после плавленния и гибридизации олига с концом одной из цепей может достроить вторую цепь до конца(вроде полимеразной цепной реакции) .

Т.е. в итоге после одной ПЦР из одной ДНК в идеале получится одна функционализованная ДНК и одна такая же ДНК, так?
А функционализованный "праймер" какой длины должен быть?

Олиг может быть адаптерным. Те его можно просто пришить лигазой к одному из концов ДНК функцианализованный олиг, а к другому обычный, после сделать некоторе количество циклов ПЦР и вы получете комплект ДНК на одном из концов, которой будет функцианолизован первичным амином.

А зачем пришивать еще и нефункц. олиг?

[Бухалыч]

Хм, а если, например, у ДНК один 5' и соответственно 3'
A-T-G-C-A-T-G-C-...
T-A-C-G-T-A-C-G-...
, а мы его сплавим с T-A-C-G-T-A-C-G-C-G-T-A-C-G-T-A, у нас же получится Т(ну или Y)-образная хреновина, да?

[Upstream]

Я бы попробовал наиболее прямой вариант хемоселективной сшивки типа:

[Iskander]

С дендримером возможна множественная пришивка ДНК.

Я бы попробовал ввести в праймер тиол и пришпандорить потом золотую наночастицу.

Вариант - повесить разветвитель и пришить к концу ещё 2-3 праймера (получится что-то типа "антитела" или "куриной лапки")

Из химии предпочтительнее всего клик.

[Polychemist]

Классика пришивки олигов к поверхностям (биочипы) - фосфорилированный на конце олиг, амин на поверхности (дендримере) + растворимый в воде карбодиимид. Например:
Использовали олигонуклеотид 5'-G....C, фосфорилированный по 5'-концу, предоставленный фирмой MWG-Biotech AG.
Приготовили раствор для иммобилизации, содержащий 100 мМ EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) и 100 мМ 1-метилимидазола [Rasmussen H. N., Knudsen J. N., Madsen S. A., Rasmussen S. E. Biotechnol. Int. 1999. 2. 303]. К полученному раствору добавили олигонуклеотид, доведя его концентрацию в растворе до 10 пмоль/мкл. В аминированную лунку планшета наносили 100 мкл смеси и инкубировали 15 ч при 45 °С. По окончании реакции лунку трижды промыли 100 мM Tris-HCl (pH 7.5), 150 мM NaCl и 0.1 % Tween-20, инкубировали 5 мин и промыли ещё три раза этим же раствором при комнатной температуре.

[Бухалыч]

Большое спасибо высказавшимся коллегам!
Остановились пока на варианте сплавления с олигом, пополам комплиментарным с 3 и 5" - концами.
Такое наверняка делалось, да? Буду премного благодарен за соответствующую литературу.

[rotten-fruit]

Вопрос, собственно, такой:
Как пришпандорить что-либо к одному из концов ДНК (любому)?
Планируется пришпандоривать кусок дендримера; хотелось бы, чтоб он не отваливался при электрофорезе (в а.г.)

Могу посоветовать книгу Bioconjugate Techniques http://books.google.ru/books?id=alooWMk ... t&resnum=4. Там Вы найдете все что Ваша душа не пожелает, а олигонуклеотиды где-то с 970 страницы.

[Бухалыч]

rotten-fruit, спасибо! Зачитаем.