Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
mtoluicacid
Сообщения: 88
Зарегистрирован: Вт май 14, 2019 2:44 am

Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

Сообщение mtoluicacid » Вт мар 03, 2020 8:30 pm

Всех приветствую, коллеги!

Какой общий принцип и подход к исследованию пути биосинтеза - т.е. цепочки биохимических превращений от предшествующих веществ к интересуемому в биологической системе?
Какие ферменты на каком шаге участвуют и какие, соответсвенно, гены кодируют эти ферменты - как это исследовать?

Допустим, интересует биохимический путь синтеза матрицина из эфирного масла ромашки аптечной для дальнейшего введения цепочки генов в плазмиду для экспрессии в E. Coli на подходящем субстрате для, собственно, дальнейшего извлечения в промышленных масштабах этого самого матрицина.
Есть ли какая нибудь фундаментальная литература, где детально описан общий принцип и подход к решению такого класса задач?
Где подробно описаны процедуры и протоколы, чтобы это уже можно было повторить в лаборатории?
Благодарю за любой ответ!

2rin
Сообщения: 400
Зарегистрирован: Вт май 11, 2010 8:58 pm

Re: Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

Сообщение 2rin » Пт мар 13, 2020 11:55 pm

Матрицин - терпен. Соответственно, делается терпен-синтазами. Надо секвенировать ромашку и искать там соответствующий кластер генов. Найти его не так сложно, как отсеквенировать растение. Специалистов по биосинтезу природных соединений у нас нету, тут Вам мало кто поможет. Да и в целом, тема эта в процессе становления: сложное это дело. Чтобы прям совсем во всем разобраться, по классике, надо кормить ромашку мечеными прекурсорами (2Н и 13С), а потом смотреть, в какое место в матрицине они попали с помощью ЯМР и МС. И отдельные ферменты надо выделять и характеризовать и прочая. Работа большая и тягостная, требует разных специалистов - химиков, биохимиков, молбиологов и генных слесарей.
По многим классам компаундов (поликетиды, например) хоть какая-то ясность начала появляться только в последние лет пять-десять и учебников (да и просто хороших обзоров) нету. Гуглите "sesquiterpene synthase" и просвещайтесь.
Так, навскидку, https://www.elsevier.com/books/natural- ... 2-394290-6
Но это 2012 год и многое уже устарело, думается мне.

Аватара пользователя
chemist
Сообщения: 10369
Зарегистрирован: Пн июл 26, 2004 2:14 am

Re: Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

Сообщение chemist » Вт мар 24, 2020 3:18 pm

Думаю, для извлечения в промышленных масштабах этого самого матрицина не обязательно знать биохимический путь его синтеза в ромашке аптечной, главное чтобы его было побольше в масле. Если в масле не так много сложноэфирных примесей, можно на первых порах выделить сырец матрицина омылением щёлочью, очистить и замкнуть цикл обратно. Если этого будет недостаточно, можно поиграть и на кетонной группе для дополнительной очистки.
I D E A = A u

mtoluicacid
Сообщения: 88
Зарегистрирован: Вт май 14, 2019 2:44 am

Re: Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

Сообщение mtoluicacid » Чт мар 26, 2020 5:41 pm

chemist писал(а):
Вт мар 24, 2020 3:18 pm
Думаю, для извлечения в промышленных масштабах этого самого матрицина не обязательно знать биохимический путь его синтеза в ромашке аптечной, главное чтобы его было побольше в масле. Если в масле не так много сложноэфирных примесей, можно на первых порах выделить сырец матрицина омылением щёлочью, очистить и замкнуть цикл обратно. Если этого будет недостаточно, можно поиграть и на кетонной группе для дополнительной очистки.
Большое спасибо за Ваши ответы!
Одна из задач выделение в промышленных масштабах не только матрицина но и других метаболитов из совсем других организмов.
Поэтому хочется овладеть методами универсальными.
Второй задачей может оказаться введение изученной цепочки генов в другой организм, чтобы в этом организме синтезировались метаболиты, ранее не присущие этому организму.

Аватара пользователя
chemist
Сообщения: 10369
Зарегистрирован: Пн июл 26, 2004 2:14 am

Re: Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

Сообщение chemist » Чт мар 26, 2020 10:21 pm

Да уж, плану у Вас грандиозные, тут и генная инженерия, и биотехнология, и... неужели есть столько денег и времени? А главное - платёжеспособных покупателей всего этого добра? :wink:
I D E A = A u

mtoluicacid
Сообщения: 88
Зарегистрирован: Вт май 14, 2019 2:44 am

Re: Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

Сообщение mtoluicacid » Чт мар 26, 2020 11:04 pm

2rin писал(а):
Пт мар 13, 2020 11:55 pm
Матрицин - терпен. Соответственно, делается терпен-синтазами. Надо секвенировать ромашку и искать там соответствующий кластер генов. Найти его не так сложно, как отсеквенировать растение.
Очень благодрен вашему ответу!
А как подобные кластеры генов ищутся, что вы имели в виду? Если терпен-синтазы имеют схожие последовательности, то таким образом методами биоинформатики осуществляется метагеномный поиск похожих генов(ортологичных генов) в BLASTе ?
Если я правильно понял, то следующая последовательность достаточно тривиальна:
Выделение суммарной РНК, анализ ее на геле, синтез кДНК, амплификация целевого гена с помощью праймеров, далее ввести полигистидиновый tag и весь конструкт в плазмиду для экспрессии в E.Coli, культивирование, выделение и далее His-tag-колонка. После этого соответственно проведение биохимической реакции инвитро для подтверждения, что белок действительно обладает теми самыми каталитичсекими свойствами. И так со всеми белками, пока не выстроится полный биохимический путь. Верно?
2rin писал(а):
Пт мар 13, 2020 11:55 pm
Чтобы прям совсем во всем разобраться, по классике, надо кормить ромашку мечеными прекурсорами (2Н и 13С), а потом смотреть, в какое место в матрицине они попали с помощью ЯМР и МС.
А вот по этой теме, что можете из литературы порекомендовать? Судя по подробному описанию вы занимались этим непосредственно. Здесь очень много своих хитростей - можно сказать без преувеличения, что это целое искусство!
2rin писал(а):
Пт мар 13, 2020 11:55 pm
По многим классам компаундов (поликетиды, например) хоть какая-то ясность начала появляться только в последние лет пять-десять и учебников (да и просто хороших обзоров) нету. Гуглите "sesquiterpene synthase" и просвещайтесь.
А по другим классам соединений возможно что-то есть и тогда по аналогии применить к сесквитерпенам. Методы же не меняются.

P.s. - Почему вы считатете секвенирование затруднением? Сейчас вполне себе стали доступными Ion torrent PGM б.у. на ebay.
Да и просто заказать сиквенс на стороне. Сейчас полногеномное секвенирование стало доступным по цене даже для самой хилой лабы.
2rin писал(а):
Пт мар 13, 2020 11:55 pm
Найти его не так сложно, как отсеквенировать растение.

Nickolas
Сообщения: 1530
Зарегистрирован: Пн авг 27, 2007 8:15 pm

Re: Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

Сообщение Nickolas » Вс мар 29, 2020 12:18 am

mtoluicacid писал(а):
Чт мар 26, 2020 11:04 pm
Выделение суммарной РНК, анализ ее на геле, синтез кДНК, амплификация целевого гена с помощью праймеров, далее ввести полигистидиновый tag и весь конструкт в плазмиду для экспрессии в E.Coli, культивирование, выделение и далее His-tag-колонка. После этого соответственно проведение биохимической реакции инвитро для подтверждения, что белок действительно обладает теми самыми каталитичсекими свойствами. И так со всеми белками, пока не выстроится полный биохимический путь. Верно?
Ага, если эти белки нормально экспрессируются, зафолдятся, не выпадут из раствора и все еще будут каталитически активны..

2rin
Сообщения: 400
Зарегистрирован: Вт май 11, 2010 8:58 pm

Re: Методы исследования биохимических путей синтеза веществ.

Сообщение 2rin » Пн мар 30, 2020 1:37 pm

mtoluicacid писал(а):
Чт мар 26, 2020 11:04 pm
А как подобные кластеры генов ищутся, что вы имели в виду? Если терпен-синтазы имеют схожие последовательности, то таким образом методами биоинформатики осуществляется метагеномный поиск похожих генов (ортологичных генов) в BLASTе ?
Все так, ищется. Есть и специализированные БД по биосинтетическим генным кластерам (MIBiG), там можно дополнительно копаться по похожим BGC.
mtoluicacid писал(а):
Чт мар 26, 2020 11:04 pm
Если я правильно понял, то следующая последовательность достаточно тривиальна:
Выделение суммарной РНК, анализ ее на геле, синтез кДНК, амплификация целевого гена с помощью праймеров, далее ввести полигистидиновый tag и весь конструкт в плазмиду для экспрессии в E.Coli, культивирование, выделение и далее His-tag-колонка. После этого соответственно проведение биохимической реакции инвитро для подтверждения, что белок действительно обладает теми самыми каталитичсекими свойствами. И так со всеми белками, пока не выстроится полный биохимический путь. Верно?
Ну, в общем, наверное. Только у меня сразу возникают некоторые вопросы. 1. Как достать ДНК/РНК из ромашки? У растений хорошая такая клеточная стенка и не так-то просто добраться до содержимого без потерь. Да, конечно, люди работают, и даже со злаками (которые агробактерия не берет), но это не всегда просто и тривиально. С растениями я не работал, поэтому и считаю получение сиквенса не таким уж плевым делом. У нас хороший сиквенс актиномицета получился-то не с первого раза (то днк не выделялась, то ошибок много, то сборка плохая). 2. Обычно BGC - не один крохотный ген, а здоровая такая конструкция, которая не всегда в плазмиду может поместиться. Есть много литературы про космиды и прочие техники для переноса BGC между геномами. Потом, не факт, что пересаженный BGC начнет работать, т.к. часто ему нужны "сторонние" (из других участков генома) ферменты или продукты их деятельности. Регуляторные каскады, опять же. Они есть не только у высших животных, типа человеков, но даже у прокариот. Просто изучаются гораздо меньше. Часто биоситез вторичных метаболитов запускается только на поздних стадиях развития, и это происходит путем сложной регуляции, которую не всегда можно понять и воспроизвести. 3. Анализ на уровне отдельных белков - ну это уровень ACS Chem. Bio. и выше, т.к. экспрессия у них не очень и найти и доказать там что-то очень и очень сложно. Это, во-первых, нужен способ селективно задетектировать. И потом накормить каким-то прекурсором, чтоб он его во что-то превратил. Да и часто они "по одиночке" не хотят работать, только "в сборе". Взаимодействия белок-белок там критичны.
Короче, вопросов и проблем тут больше, чем готовых рецептов. Не зря подобного рода работы публикуют в журналах уровня выше среднего.
mtoluicacid писал(а):
Чт мар 26, 2020 11:04 pm
А вот по этой теме, что можете из литературы порекомендовать? Судя по подробному описанию вы занимались этим непосредственно. Здесь очень много своих хитростей - можно сказать без преувеличения, что это целое искусство!
Занимались, да. И сейчас пытаемся. Ну, в двух словах я и так описал, что нужно. А вот детали - самое интересное - надо искать в статьях, да и метод выделения и детекции подбирать под конкретное вещество. Это, опять же, не на уровне "прочитал - воспроизвел". Как в известном анекдоте "Ну, тут мастер нужен".
Если очень интересно, можете зайти к нам после карантина, пообщаться вживую. Если чем-то сможем помочь, то хорошо. Напишите в ЛС, скину контакты.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 14 гостей