Синтез рнк
Синтез рнк
Добрый день, друзья.
Друзья, в методике по очистке осаждению рнк используется бутанол. При осаждении же днк-этанол или изопропанол . В случае днк понятно- этанол смешивается с водой и вытесняет днк. Бутанол же плохо смешивается с водой. В этом случае не ясен смысл его применения. Может в большей полярности рнк дело?
Друзья, в методике по очистке осаждению рнк используется бутанол. При осаждении же днк-этанол или изопропанол . В случае днк понятно- этанол смешивается с водой и вытесняет днк. Бутанол же плохо смешивается с водой. В этом случае не ясен смысл его применения. Может в большей полярности рнк дело?
Re: Синтез рнк
нехилое дело затеили
знаком с биологами что такое делали - морока еще та
и все это в мизерном мастшабе
сочувствую
знаком с биологами что такое делали - морока еще та
и все это в мизерном мастшабе
сочувствую
Re: Синтез рнк
Из вашего протокола не ясно, к какому объему добавляют 25мкл ацетата. По идее этот объем 250 мкл. Но при ттаком раскладе скорее всего такая смесь расслоится на водный и органический слой. Водного правда будет очень мало микролитров 50-100. Так что не очень понятно что имели ввиду авторы протокола. Воще РНК как и ДНК любят вываливать этанолом, ну иногда изо пропанолом(его надо брать в меньших количествах по отношению к водному раствору НК), про бутанол слышу первый раз. Бутанолом иногда концентрируют водные растворы . Так как при смешении с ним образуется органическая фаза, которая втягивает в себя часть воды из раствора.
Re: Синтез рнк
Наверно образуется гидратная шуба и поэтому втягивает. Хотя задавался вопросом почему именно он этим свойством обладает, а не метанол или этанол, напримерavor писал(а): ↑Вс авг 18, 2019 8:09 pmИз вашего протокола не ясно, к какому объему добавляют 25мкл ацетата. По идее этот объем 250 мкл. Но при ттаком раскладе скорее всего такая смесь расслоится на водный и органический слой. Водного правда будет очень мало микролитров 50-100. Так что не очень понятно что имели ввиду авторы протокола. Воще РНК как и ДНК любят вываливать этанолом, ну иногда изо пропанолом(его надо брать в меньших количествах по отношению к водному раствору НК), про бутанол слышу первый раз. Бутанолом иногда концентрируют водные растворы . Так как при смешении с ним образуется органическая фаза, которая втягивает в себя часть воды из раствора.
Похоже это все вливают в шаг 2 выше, тк в источнике пишут- охладите в морозильной камере перед обессоливанием
Скажите пожалуйста, почему изопропанола меньше добавляют?
Как я делал с днк после фореза:
- вытягивал воду из буфера ТЕ бутанолом-2
- промывал эфиром, центрифугирование
- подупаривал остатки бутанола /эфира
- добавлял 99 % этанол и соли
-морозилка
-центрифугирование, промывка 75% этанолом , центрифугирование
- декантирование водного слоя, высушивание
Можно наверно и с рнк так, но там полярность выше. Не знаю на 100% ли подойдёт эта схема?....
Re: Синтез рнк
Высаживает лучше.(обычно добавляют 0,6-0,7V водного раствора)Скажите пожалуйста, почему изопропанола меньше добавляют?
В принципе подойдет, но в ней много лишнего(например, бутанол и эфир - они нужны только если вы хотите концентрировать НК и ее у вас отчаянно мало. Но сейчас в таких случаях используют соосадитель например ПААГ(линейный) или гликоген, если конечно они не мешают дальнейшим манипуляциям.Не знаю на 100% ли подойдёт эта схема?....
Re: Синтез рнк
Спасибо, будем знать. Они эффективнее в плане выхода днк?avor писал(а): ↑Вс авг 18, 2019 10:18 pmВысаживает лучше.(обычно добавляют 0,6-0,7V водного раствора)Скажите пожалуйста, почему изопропанола меньше добавляют?В принципе подойдет, но в ней много лишнего(например, бутанол и эфир - они нужны только если вы хотите концентрировать НК и ее у вас отчаянно мало. Но сейчас в таких случаях используют соосадитель например ПААГ(линейный) или гликоген, если конечно они не мешают дальнейшим манипуляциям.Не знаю на 100% ли подойдёт эта схема?....
Да, у нас ее действительно мало, делаем отрезки и по 80 нуклеотидов. То есть , если много днк можно бухать этанола без концентрирования?
Прочёл , что с изопропанолом можно не морозить днк, а сразу центрифугировать. Интересно
Последний раз редактировалось Union Пн авг 19, 2019 12:02 am, всего редактировалось 1 раз.
Re: Синтез рнк
Если на 2’ останется защитная группа, например, ацетильная, как это повлияет на дальнейшее поведение рнк, например на перевод в днк обратной транскрипцией?
Re: Синтез рнк
--То есть , если много днк можно бухать этанола без концентрирования?
Ну много/мало все относительно. Где то мг/л высаживается просто спиртом. Главное не забывать соль какую-нибудь добавлять. Меньше тоже высаживается, но хуже.
--Прочёл , что с изопропанолом можно не морозить днк, а сразу центрифугировать. Интересно
Со спиртом тоже можно не морозить(Но я морожу. Тут два процесса конкурируют: растворимость, которая падает с низкой температурой и скорость коагуляции, которая тоже падает с падением температуры), а вот сразу центрифугировать не стоит, осадок должен созреть, поэтому даже на комнате раствор надо выдержать 30' хотя бы.
--Если на 2’ останется защитная группа, например, ацетильная, как это повлияет на дальнейшее поведение рнк, например на перевод в днк обратной транскрипцией?
Думаю ревертаза ее просто не узнает. ДНКаза и РНКаза различают одну гидрокси группу, а тут ацетат целый.
Не проще ли синтезировать 80b фрагмент ДНК, чем мучаться с ревертированием РНК.
Ну много/мало все относительно. Где то мг/л высаживается просто спиртом. Главное не забывать соль какую-нибудь добавлять. Меньше тоже высаживается, но хуже.
--Прочёл , что с изопропанолом можно не морозить днк, а сразу центрифугировать. Интересно
Со спиртом тоже можно не морозить(Но я морожу. Тут два процесса конкурируют: растворимость, которая падает с низкой температурой и скорость коагуляции, которая тоже падает с падением температуры), а вот сразу центрифугировать не стоит, осадок должен созреть, поэтому даже на комнате раствор надо выдержать 30' хотя бы.
--Если на 2’ останется защитная группа, например, ацетильная, как это повлияет на дальнейшее поведение рнк, например на перевод в днк обратной транскрипцией?
Думаю ревертаза ее просто не узнает. ДНКаза и РНКаза различают одну гидрокси группу, а тут ацетат целый.
Не проще ли синтезировать 80b фрагмент ДНК, чем мучаться с ревертированием РНК.
Re: Синтез рнк
Спасибо!avor писал(а): ↑Пн авг 19, 2019 8:22 am--То есть , если много днк можно бухать этанола без концентрирования?
Ну много/мало все относительно. Где то мг/л высаживается просто спиртом. Главное не забывать соль какую-нибудь добавлять. Меньше тоже высаживается, но хуже.
--Прочёл , что с изопропанолом можно не морозить днк, а сразу центрифугировать. Интересно
Со спиртом тоже можно не морозить(Но я морожу. Тут два процесса конкурируют: растворимость, которая падает с низкой температурой и скорость коагуляции, которая тоже падает с падением температуры), а вот сразу центрифугировать не стоит, осадок должен созреть, поэтому даже на комнате раствор надо выдержать 30' хотя бы.
--Если на 2’ останется защитная группа, например, ацетильная, как это повлияет на дальнейшее поведение рнк, например на перевод в днк обратной транскрипцией?
Думаю ревертаза ее просто не узнает. ДНКаза и РНКаза различают одну гидрокси группу, а тут ацетат целый.
Не проще ли синтезировать 80b фрагмент ДНК, чем мучаться с ревертированием РНК.
Нам же и выгоднее, чтобы рнк максимально вылезла из воды спиртом. А слипнутся потом на максимальных скоростях центрифуги. Я на час оставлял при -70.
Конечно проще.вопрос был чисто теоретическим) вы имели ввиду ревертазу? Я про узнавание
Вот предложили колонки для синтеза с первой посаженной буквой. Две-2’-Tom 3’ cpg , но две другие- 3’tom 2’cpg. Мне не нравится направленность двух последних. Но с другой стороны, это буквы cpg, защитные группы снимутся аммонолизом и просто останутся две он группы
Решаю загадку века. Пытаюсь понять, почему при снятии защитных групп в случае EDA в этаноле , некоторые снятия при 0С происходят быстрее, чем аналогичные при rt..
Re: Синтез рнк
Да их практически не осталось, кто умер , кто на пенсию ушел и сидит дома или на даче.
Тяжелый синтез и без ВЭЖХ мало эффективен - это анализ и очистка.
Тяжелый синтез и без ВЭЖХ мало эффективен - это анализ и очистка.
Re: Синтез рнк
Вольному воля, только вот без ВЭЖХ блуждание в потемках.
Посмотрите импортные работы.
А это все стоит немалых денег.
Просто ВЭЖХ занимался с 79 года и не один десяток лет. Могу сорбент сделать колонку упаковать и много еще чего.
Было в группе 7 жидкостных хроматографов во времена Союза, они все умерли - электроника долго не живет.
Вот так и живем.
Посмотрите импортные работы.
А это все стоит немалых денег.
Просто ВЭЖХ занимался с 79 года и не один десяток лет. Могу сорбент сделать колонку упаковать и много еще чего.
Было в группе 7 жидкостных хроматографов во времена Союза, они все умерли - электроника долго не живет.
Вот так и живем.
Re: Синтез рнк
Все зависит от от масштаба синтеза. Больше 25 оптей - ВЭЖХ, 3-10 - оптей форез
Re: Синтез рнк
Мне будут нужны пикограммы)StYV писал(а): ↑Пн авг 19, 2019 3:17 pmВольному воля, только вот без ВЭЖХ блуждание в потемках.
Посмотрите импортные работы.
А это все стоит немалых денег.
Просто ВЭЖХ занимался с 79 года и не один десяток лет. Могу сорбент сделать колонку упаковать и много еще чего.
Было в группе 7 жидкостных хроматографов во времена Союза, они все умерли - электроника долго не живет.
Вот так и живем.
Re: Синтез рнк
Ну пикогрммы можно осилить на обычной колонке с диаметром 4-4.6 мм.
Все зависит от того как делиться.
Давно все это было, ничего не осталось.
Все зависит от того как делиться.
Давно все это было, ничего не осталось.
Re: Синтез рнк
Успехов,
дорогу осилит идущий.
Но оборудование надо иметь.
дорогу осилит идущий.
Но оборудование надо иметь.
Кто сейчас на конференции
Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 59 гостей