Стабильность РНК в водном растворе

[palek]

Ищу условия для обеспечения гидролитической стабильности цепочки РНК в водных р-рах при комнатной температуре. Трёхмерная структура не важна.
Где-то мельком читал, что раствор роданида аммония игнибирует гидролиз. Так ли это? Что можно добавить для подавления всяких РНКаз и обычного гидролиза? Поможет ли добавление спирта? ДМСО?
Заранее спасибо за советы специалистов.

[avor]

Гидролиз ни один из этих способов не ингибирует.
Ингибирование именно гидролиза происходит, если РНК не в растворе, а в осадке, например, при высаживании спиртовыми растворами. Все выше перечисленные способы ингибируют фермент РНКазу. Есть ингибиторы например диэтилпирокарбонат, но это вообще сильно активная штука, которая потенциально может реагировать с РНКой(никто не проверял). Растворы роданидов(4-5М), а лучше роданидов гуанидиния(5-6М(практически насыщенный)), а так же гуанидиния хлориды 5-7М фермент не ингибируют, а денатурируют. Есть такой растворчег RNALAter по сути забуференный цитратом раствор сульфата аммония, он просто переводит РНКазу в осадок. Вот выписка из US патента 6,528,641 "In a beaker, combine 40 ml 0.5 M EDTA, 25 ml 1M Sodium Citrate, 700 gm Ammonium Sulfate and 935 ml of sterile distilled water, stir on a hot plate stirrer on low heat until the Ammonium Sulfate is completely dissolved. Allow to cool, adjust the pH of the solution to pH5.2 using 1M H2SO4. Transfer to a screw top bottle and store either at room temperature or refrigerated". Так же говорят что добавление тиол агентов к сульфату аммония типа меркаптоэтанол, дитиотриэтола тоже частично ингибируют РНКазу. Еще один способ избавится от РНКазы это обработать все растворы протеазами. Обычно используют злые неспецифичные протезы типа проназа и протеиназа К, при чем прежде чем ими пользоваться растворы с ферментом выдерживают на 37 градусах 30-60 минут, что бы в них разрушилась примесь РНКазы.

[palek]

Нравится денатурирование концентрированными солями роданида аммония и гуанидиния и хлорида гуанидиния. Насколько оно надёжно и необратимо? Можно ли заменить аммоний на триэтиламмоний?

[avor]

Оно полностью обратимо при их удалении из раствора(или разбавлении) РНКаза ренатурирует и восстанавливает свою активность, более того получить препарат этих солей свободный от загрязнения РНКазой нетривиальная задача. Заменить на триэтиламмоний можно, но думаю это будет хуже и это тертически может в определенных условиях вызвать выпадение РНК в осадок.

[Мармозет]

А что потом делать с РНК собираетесь?
Покупаете набор для выделения РНК и вперед. Там как раз гуанидином РНКазу долбят, потом на колонке отделяют РНК от прочего, смывают свободной от РНКаз водой и обретают щщасьсье.
Следует иметь ввиду, что основной загрязнитель РНКазой это собственные лапки экспериментатора. Так что посуду обрабатывать диэтилпирокарбонатом. Стол тоже. Перчатки одноразовые после надевания. Не обязательно ДЕПК, есть и другие гадости для обработки поверхностей. Пипетки желательно с фильтрами и только для работы с РНК и, разумеется, только на одного пользователя. Пластик для работы с пометкой RNase-free. Продаются ингибиторы рибонуклеаз для добавления в раствор. Но можно и без них, если руки не кривые. Соли и буферы и прочие водные растворы фильтровать через нейлон. На него белки хорошо липнут. Я даже растворы ПЭГ и глицерина умудрялся фильтровать. Фильтрование обязательно, поскольку всякая живность в растворах тоже лишняя. Есть свободные от РНКаз реактивы, это в каталогах смотреть. Вода из милипоровской водоочистки довольно чистая. Ну, словом, как-то так. Мне всего указанного выше хватало для кристаллизации РНК-белково-нуклеотидных комплексов как раз таки при комнатной температуре много-много дней.