Биуретовая реакция (конц. белка в лизатах тканей)

[Demiurg]

Здравствуйте!

Известно, что практически для каждого из наиболее распространенных методов определения концентрации белка (Biuret, Hartree-Lowry, Bicinchonic acid, Acid digestion-ninhydrin, UV adsorption, Bradford, Dry weigh) существуют небелковые вещества, которые искажают определение концентрации (дают аналогичную окраску, препятствуют её развитию или же мешают как-то иначе) - т.н. interfering compaunds.
Интересует биуретовый метод (биуретовая реакция). Для неё такими вот interfering compaunds являются сульфат аммония, глюкоза, фосфат натрия (в источнике, где я это нашел, не указано, какой именно фосфат - приведено Sodium phosphate) и сульфгидрильные соединения. Таблица 3.4.3 приложения.
Так вот, есть у меня лизаты тканей, которые потом пойдут (если пойдут) на форез (ну дальше перенос на мембрану и вестерн, ничего особенного). Хорошо бы было узнать концентрацию белка в лизатах, что бы в карманы геля наносить одинаковое кол-во белка. Так вот смущает вот что. Ни сульфата аммония, ни глюкозы, ни фосфата натрия в лизатах нет (хотя что имеется в виду насчет последнего мне не ясно, может интерферирует именно фосфат-ион). Но, само собой, есть сульфгидрильные соединения (глутатион и много чего еще) из самих клеток ткани. Плюс фосфат (от АТФ и прочего). Вот они то, наверное, и будут интерферировать.
Интересуют следующие вопросы:
1) будут ли мешать (интерферировать) естественные внутриклеточные сульфьгидрильные соединения?
2) будут ли мешать внутриклеточные фосфат-ионы?
3) искажают ли определение белков биуретовым методом сами сульфгидрильные группы белков?

P.S. из того, что у меня получилось (делал с помощью фирменного набора для определения общего белка на основе биуретовой реакции; соотношение (объемов проба: реагент) - 1:50; 540 нм, длина оптического пути - 1 см, общий объем реакционной смеси - 1020 мкл, кварцевая кювета). Холостая проба-1 (реагент + дистиллят) - 0,930 OD, холостая проба-2 (реагент + Ripa-buffer) - 0,942 OD. В чем причина того, что во втором случае оптическая плотность выше?
Ripa-buffer - это http://www.cytographica.com/lab/solutions/RIPA.htm (плюс еще Triton X-100 в такой же концентрации, как и NP-40; плюс коктейль ингибиторов протеаз P8340 Sigma (ссылку не даю - все равно она регионзависима), разведенный 1:200 этим самым ripa-буфером). Этим Ripa-буфером (с Тритоном и протеазными ингибиторами) и получались лизаты тканей. Его компоненты нигде не указаны как интерферирующие для биуретового метода.

Можно конечно выбрать и другой буфер для лизиса (исходя из его состава, некоторые методы (тот же Брэдфорд) отпадают заранее). Но вопросы именно по биуретовой реакции интересуют все равно.

Спасибо!

[Iskander]

Интересует биуретовый метод (биуретовая реакция). Для неё такими вот interfering compaunds являются сульфат аммония, глюкоза, фосфат натрия (в источнике, где я это нашел, не указано, какой именно фосфат - приведено Sodium phosphate) и сульфгидрильные соединения. Таблица 3.4.3 приложения.

Биуретова проба идёт в щелочной среде. Так что какой там был исходный фосфат не принципиально.

Но, само собой, есть сульфгидрильные соединения (глутатион и много чего еще) из самих клеток ткани. Плюс фосфат (от АТФ и прочего). Вот они то, наверное, и будут интерферировать.
Интересуют следующие вопросы:
1) будут ли мешать (интерферировать) естественные внутриклеточные сульфьгидрильные соединения?
2) будут ли мешать внутриклеточные фосфат-ионы?
3) искажают ли определение белков биуретовым методом сами сульфгидрильные группы белков?

1 возможно. Проще капнуть немного перекиси водорода и избавиться от всей низковалентной серы. Сульфоксиды, сульфоны и сульфокислоты уже не помеха.
2 думаю нет. Их мало, да и вклад в оптическую плотность сопоставим с погрешностью прибора.
3 Скорее всего нет.

Холостая проба-1 (реагент + дистиллят) - 0,930 OD, холостая проба-2 (реагент + Ripa-buffer) - 0,942 OD. В чем причина того, что во втором случае оптическая плотность выше?

Может, туда парабена капнули или ещё какого консерванта.

[Vanya Ivanov]

Сколько я помню этот метод - он хорошо работает при концентрации белка в "среднем диапазоне" 1 - 100 мг/мл. И естественно, что интерферирующие в-ва (если это естественные смеси) будут вам мешать если концентрация белка в лизатах будет у нижней границы. Если в середине или у верхней границы, то все пофиг ....как-то так.