дельта-токсин Bacillus thuringiensis

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
Мари-шка
Сообщения: 11
Зарегистрирован: Вт ноя 20, 2012 1:38 pm

дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение Мари-шка » Пн янв 21, 2013 9:05 am

Здравствуйте, участники форума!
У меня такой вопрос. Наша лаборатория занимается биопестицидами на основе Bacillus thuringiensis в том числе. У нас стоит вопрос о количественном определении действующего начала, т.е. дельта-эндотоксина. Есть методика спектрофотометрического определения, но начальство не устраивает, мол определеяете все белки которые там есть, а не конкретно белок токсина. Нужна ВЭЖХ, но нет стандарта токсина!Может быть что-то другое можно использовать в качестве стандарта? БСА? К тому же метод очистки какой-то другой должен быть....?
Наша методика в кратце такова: очищаем КЖ дист. водой и центрифугированием, растворяем кристаллы токсина в гидроксиде натрия с рН 11,0, снова фугуем, получаем растворенный белок токсина, осаждаем уксусной кислотой, снова фугуем, растворяем осадок в гидроксиде натрия с рН 11,0 и замеряем на спектрофотометре при 280нм, далее по формуле.
Может кто-то работал с токсинами бактерий? Поделитесь опытом, пожалуйста!

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 12650
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение avor » Пн янв 21, 2013 9:30 am

А что такое КЖ(попа павиана? :))? АААА! Понял! Культуральная жидкозть! Но тогда непонятно как ее можно очистить водой. Центрифугированием ее можно, так сказать, от осадка очистить. А водой!? :issue: :dontknow:

И кстати эта КЖ это среда + организмы продуцента или чистая среда без бактерий?


Вы как чистоту токсина определяете? Если у вас чистота выше 90%, то плевать вам на побочные белки. Можно определять по токсичности, грубо говоря по биоактивности(ингибирование роста или фермента). Можно определять ИФА(иммуноферментный анализ). Но в вашем случае может подойти простой РИД(радиально иммунодифузия), В любм случае ннужен стандарт, а для иммунных еще и и антитела.

Аватара пользователя
Vanya Ivanov
Сообщения: 1767
Зарегистрирован: Пн авг 29, 2005 6:40 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение Vanya Ivanov » Пн янв 21, 2013 11:25 am

Если у Вас есть кристаллы дельта-токсина - это же наиболее чистая форма белка (наверное лучше чем стандарт!).
А метод анализа ВЭЖХ вашего белка и обучение персонала - закажите у конторки, которая продаст вам оборудование ВЭЖХ под этот анализ (ну раз начальство хочет, то и копейку даст, не так ли?)

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 12650
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение avor » Пн янв 21, 2013 11:29 am

Вряд ли это настоящие кристаллы. К тому же кристаллы белка полученные из смеси могут содержать чр те что, это если они хорошо кристаллизуются, а если плохо, то их просто не будет.

Мари-шка
Сообщения: 11
Зарегистрирован: Вт ноя 20, 2012 1:38 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение Мари-шка » Вт янв 22, 2013 6:46 am

Культуральная жидкость - это пит. среда с клетками и продуктами жизнедеятельности бактерий. Центрифугированием отмываем соли растворенные в КЖ. А осадок после центрифугирования нам как раз таки нужен- там и находятся кристаллы токсина, вышедшие из клетки. Токсин в бакт.клетке находится в форме кристалла, там есть и споры. В конце ферментации клетки лизируются, кристаллы и споры выходят наружу. Центрифугированием мы их собираем и еще остатки пит. среды.
Биологическая активность это на самом деле то, что нужно, но у нас нет инсектария, чтобы каждую пробу определять. Мы только на регистрационные испытания отправляем на биол. активность. Начальство не устраивает этот показатель, оно считает что чем больше токсина, тем лучше, а какова его активность их не интересует!Попробуй докажи!
Чистоту мы не определяем. Может действительно определить чистоту беока токсина, чтобы доказать нач-ву состоятельность нашей методики! Если честно я не знаю как ее определеить?((( подскажите!

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 12650
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение avor » Вт янв 22, 2013 10:06 am

ЭЭЭ! Мдя! Почитал я про эту хрень. Вы конечно можете сделать Лэмли-форез своего токсина и как бы посмотреть на его чистоту, Но токсин сам по себе представляет смесь белков. Про биологическую активность тоже все сложно это мембранный яд. А следовательно для его обнаружения нужны сложные модели(культуры клеток) и сложное оборудование и высококвалифицированные специалисты(измерение мембранных потенциалов).

На самом деле я не вижу более простого и надежного способа, чем отмыть кристаллы убедится, что в надосадке над кристаллами нет поглощения на 280нм и потом измерить поглощение кристаллов на 280нм, предварительно растворив их.

Аватара пользователя
Vanya Ivanov
Сообщения: 1767
Зарегистрирован: Пн авг 29, 2005 6:40 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение Vanya Ivanov » Вт янв 22, 2013 5:02 pm

УФ-спектрофотометрия заведомо не дает показателей чистоты белка! Ну нет там характеристических параметров. Если с вэжх возиться лень и дорого, то тогда уж самый простейший ПААГ-электрофорез - что проще (примесные белки), или еще лучше ручками под увеличительным стеклом отобрать порцию кристаллов и отдать протеомщикам на ESI-MS, всего то 0.5-3 тыров и вы знаете чистоту кристаллов.
В Москве определить чистоту белка - плевое дело. Не понимаю я в чем вопрос?
Все аналитические методики расписать бесплатно , что ли?

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 12650
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение avor » Вт янв 22, 2013 9:41 pm

--УФ-спектрофотометрия заведомо не дает показателей чистоты белка! Ну нет там характеристических параметров.

Да это все очевидно. Но в данном конкретном случае, в большем нет смысла. Белок весьма специфичный, образует нативный нерастворимый комплекс из нескольких субъединиц. Ожидать там примесей можно только в растворе. Поставить Лэмли-форез, да можно. И что мы там увидим - несколько зон в районе 130 кДа и возможно еще протеолитические фрагменты и практически с нулевой вероятностью примесные зоны. И что это нам даст? Да практически ничего.


-Если с вэжх возиться лень и дорого, то тогда уж самый простейший

Да, отстаньте вы от этой ВЭЖХ. ВЭЖХ для белков 100кДа смерти подобно, а нерастворимые белки для ВЭЖХ подобны смерти.

ESI-MS, ну для чистоты это не очень хороший метод - это скорее метод для определение происхождения минорных примесей, да еще требует предварительной подготовки, а сколько их там в процентах это уже большой геморрой.

Мари-шка
Сообщения: 11
Зарегистрирован: Вт ноя 20, 2012 1:38 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение Мари-шка » Чт янв 24, 2013 7:53 am

Спасибо, avor! вы еще раз подтвердили мои мысли!

(На самом деле я не вижу более простого и надежного способа, чем отмыть кристаллы убедится, что в надосадке над кристаллами нет поглощения на 280нм и потом измерить поглощение кристаллов на 280нм, предварительно растворив их.)
Обязательно попробую! Еще раз спасибо!

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 12650
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: дельта-токсин Bacillus thuringiensis

Сообщение avor » Чт янв 24, 2013 11:32 am

Мне тут пришла идея что зоны полученные на форезе можно вырезать и обработать трипсином и сделать повторный форез называется пептидное картирование. Довольно специфичный метод. Но он для идентификации, а не для количественных измерений.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 5 гостей