Чем заменить ТХУ в гидролизе

[ollo88]

Уважаемые коллеги,
подскажите пожалуйста, каким способом можно остановить ферментативный гидролиз не используя ТХУ? она, как оказалось разрушительно влияет на носитель для иммобилизации протеазы, а хотелось бы использовать носитель многократно. (за основу был взят метод Ансона)

[avor]

Ингибиторов много, но для этого нужно знать какой активный центр в ферменте(например это металлопротеаза, тогда в качестве ингибитора вполне может сойти ЭДТА). Многие ингибиторы ингибируют необратимо. Вас устроит такой расклад?

[ollo88]

Да, меня устроит необратимое ингибирование, так как цель - измерить активность в определенных условиях, главное чтобы ингибитор был довольно дешевым в использовании и не разрушал хитозан и субстрат, использую сериновые и цистеиновые протеиназы, поэтому ЭДТА не подходит, он наоборот является активатором...

[avor]

Сериновые ингибирует фенилметилсульфонил фторид. Цистеиновые N-этилмалеимид оба ингибируют необратимо.

Самый дешевый способ прокипятить, но тут могут быть подводные камни, не всегда это приводит к ингибированию. А вот что будет с субстаротом вообще непонятно ибо неизвестно, что он есть.

[OCULIS, NON MANIBUS]

а в каком виде иммобилизованный препарат? быстро отделить его от инкубационной среды не получиться ? вынули бы быстренько биокатализатор и наливали бы ТХУ сколько угодно Метод Ансона ж на ТХУ расчитан, на сколько я помню, она добавляется не только для того, чтобы остановить реакцию, но и для осаждения казеина.
P.S. ммм Протеазы на хитозане - классика жанра

[Iskander]

А если нежно поменять рН? Для трипсина, например, 4 - полное обратимое ингибирование. И да, носитель с ферментом боргидридом восстанавливали?
Ещё вариант - использовать специфический ингибитор, например, соевые ингибиторы типа Кунитца.

[ollo88]

Спасибо всем за идеи.
OCULIS, NON MANIBUS, это хоть и классика, а в статьях мало кто подробно описывает, как они проводили исследования, ни в одной прочитанной мной статье не было сказано, что нужно брать не обычный казеин, а казеин по Гаммерстену, я неделю пыталась казеин обычный растворить в буфере...

[Upstream]

Как-то раз пытался выяснить, откуда у коллег-биохимиков в тканевом гомогенате берутся "эндогенные" пептиды. 1 М солянка, которую они пользовали, совсем исключить протеолиз не могла, а эмпирический подбор комбинации дорогостоящих ингибиторов при неизвестном репертуаре причинных протеаз коллег явно не вдохновлял. Тут у меня возник вполне очевидный ацкий замысел из разряда "против лома нет приёма."
Хаоотроп как орудие массового уничтожения ферментов и любых других функциональных биомакромолекул
При использовании 6М гуанидина гидрохлорида "эндогенные" пептиды в гомогенате уже не обнаруживались. Тем не менее, некоторые ферменты сохраняют изрядную дееспособность при концентрациях хаотропа выше 2М!
Подход универсальный и надёжный на все 100%. Подойдёт ли он вам, будет зависеть от чувствительности последующих процедур к присутствию хаотропа. Например, даже следы Gu*HCl и других неорганических солей посадят чувствительность и информативность масс-спектрометрии. В таком случае можно перейти на мочевину и т,д.

[OCULIS, NON MANIBUS]

Удивилась, прочитав что нигде не пишут что казеин по Гаммерстену нужен. Открыла первые попавшиеся две статьи - и правда не написано! удивительно
Еще вариант - диизопропилфторфосфат - классический ингибитор сериновых гидролаз. Правда, учитывая его токсичность - работать с ним - то еще удовольствие

[Iskander]

Хаоотроп как орудие массового уничтожения ферментов и любых других функциональных биомакромолекул

Протеиназа К работает и в хаотропах. Причём активность даже растёт.

[Upstream]

Протеиназа К работает и в хаотропах. Причём активность даже растёт.

Фишка вся в том и состоит, что начиная с определённой концентрации хаотропа белковая активность монотонно падает. Если Вы вдруг завладели информацией о белках, сохраняющих активность в 6М гуанидине или 8М мочевине, то поделитесь ею с нами, плиз.