Биодеградация коллагена под действием коллагеназы

[Chipits]

Подскажите, пожалуйста, биохимики как ускорить биодеградацию коллагена под действием коллагеназы. КОнцентрация коллагена 0,8 мас. %, ее изменить не могу, т.к. используется готовый раствор, пока что используем 500 ЕД коллагеназы. рН=7,2 трис буфера.Пока что она заканчивается где-то за неделю, но это очень долго для одного эксперимента.(

[zebrinskiyslava]

могу вот что дать
еще в Methods in Enzymology есть статьи которые могут помочь.

Код: Выделить всё

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleListURL&_method=list&_ArticleListID=1905550885&_sort=r&_st=13&view=c&_acct=C000228598&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=f8a89151e3befbbb4b76afdea02c03c7&searchtype=a

[Cherep]

заключайте длинные ссылки в тэг Code, а то они некорректно себя могут вести

[avor]

Коллагеназа какая? откуда(животина), фирма, каталожный номер? Ну и все зависит от количества фермента и еще от температуры.

[zebrinskiyslava]

откуда(животина)

Да,да,вот и я о том же.Она ведь откуда-то из Клостридиума добывается кажется?

[Chipits]

ДА из клостридиума, сигмовская

[Chipits]

температура 37 оС

[zebrinskiyslava]

...ну..если НЕ совсем серъезно,то...Берете Клостридиум и вытаскиваете из него ген коллагеназы.В этом гене изменяете кое какие кодоны что бы изменить аминокислоты в первичном пептиде особенно в регионе активного центра.И вот так создаете где-то 50 различных изоформ фермента.Все это загружаете в векторы и засовываете в культуры Е.коли(а ведь в принципе мможно и обратно в Клостридиум но он разростается по сравнению с Е коли очень очень долго).И из каждого стама получаете отдельную изоформу каждую из которой тестируете на скорость реакции и в конце концов находите ту которая быстрее всех.Ну и дальше её используете.Что тут такого трудного?

[avor]

Ну для начала каких 500ЕД CDU или FLAGPA и на какой объем 0.8% коллагена приходится эти 500ЕД? И каталожный номер Сигмы все-таки было бы неплохо. Если это CDU -ушные единицы, то 500Ед пожрут примерно 50-60мг коллагена за 5ч. если у вас его литр-8г то они пожрутся ну заа ооооочень долго коллагеназа раньше сдохнет.

[Chipits]

Коллагеназа Collagenase Sigma Cell Culture, Type IA, Активность 207 ЕД/мг твердого, FALGPA 0,54 ЕД/мг. Объясните мне полимерщику, в чем разница между этими единицами?

[avor]

Так и сколько вы коллагена зараз варите 100мг 1г 100г?
-Объясните мне полимерщику, в чем разница между этими единицами?
А я не больше вашего знаю, но в отличии от вас РТФМ лю по сайтам продавцов.

[Chipits]

Так и сколько вы коллагена зараз варите 100мг 1г 100г?
-Объясните мне полимерщику, в чем разница между этими единицами?
А я не больше вашего знаю, но в отличии от вас РТФМ лю по сайтам продавцов.

100мг

[avor]

Это, что-ли C5894-50MG?

-100мг
--Пока что она заканчивается где-то за неделю.
Долговато будет. Са2+ не забыли добавить, 10мМ? Это важный кофактор фермента, продавец рекомендует рабочую концентрацию 10мМ.

Ну если у вас все правильно возможно фермент сдох.

[Chipits]

Понимаешь в чем дело, с ферментами вообще не работал никогда до этого. Са2+ в виде какой соли? СаСl2 пойдет? Да это наверное эта коллагеназа. Где вообще можно найти вразумительную литературу на эту тему? И как рассчитал, что за неделю? Исходя из определения активности?

[avor]

--Са2+ в виде какой соли? СаСl2 пойдет?
Более чем.

-Unit Definition
One collagen digestion unit liberates peptides from collagen equivalent in ninhydrin color to 1.0 μmole of leucine in 5 hr at pH 7.4 at 37 °C in the presence of calcium ions.

Это инфа отсюды
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Pro ... KEY&F=SPEC

Далее делается грубая прикидка 1мкМ лейцина это типа 1мкМ аминокислоты(первичных аминогрупп) средняя Мв аминокислоты - ну, типа, 115. Отсюды 1 единица фермента выдает примерно 115мкг развалившихся аминокислот за 5 часов это эквивалентно 115мкг коллагена (ибо аминокислоты из него родимого при гидролизе и лезут) и это для одной единицы фермента ну следовательно для 500 ед будет 115х500/1000 мг, то бишь порядка 50-60мг ну, а сотня мг, должна валится примерно за ночь, а неделя - многовато будет, да и фермент за это время сам по рушится.

[Chipits]

Супер, просто здорово, толькоодин вопрос рылсо-рылсотам, так и не нашел про концентрацию кофактора...

[avor]

7.3.1. 50 mM Tricine with 10 mM Calcium Chloride and 400 mM Sodium Chloride, pH 7.5 at 25°C (Buffer)
Prepare an 8.96 mg/ml solution using Tricine, Sigma-Aldrich product number T0377, in purified water. Then add at 23.4 mg/ml Sodium Chloride, Sigma-Aldrich product number S9888, and adjust to pH 7.5 at 25°C with 1 M Sodium Hydroxide, Sigma-Aldrich product number S2567. Then add at 1.47 mg/ml Calcium Chloride, Sigma-Aldrich product number C3881 and recheck the pH of the solution at 25°C. If necessary, readjust to pH 7.5 at 25°C with 1 M Sodium Hydroxide, Sigma-Aldrich product number S2567 or 1 M Hydrochloric Acid, Sigma-Aldrich product number H3162.

http://www.sigmaaldrich.com/technical-d ... o-ala.html

Справедливости ради в другом документе буфер другой
Final concentrations in the reaction mixture are 50 mM
TES, 0.36 mM calcium chloride, 25 mg collagen
(Product No. C9879), and 0.005-0.01 mg collagenase.
http://www.sigmaaldrich.com/etc/mediali ... 894pis.pdf