Спектрофотометрические методы анализа белков

[inview]

Вениамин, извините, я тут немного пропал. Скажите, у Вас есть возможность проводить измерения при длине волны 205 нм?

[Осипов Веніамін]

В общем возможность есть: спектрофотометр работает в диапазоне 170 - 1000нм. Кювет, вот только, кварцевых пока нет.

[Осипов Веніамін]

Вениамин, извините, я тут немного пропал. Скажите, у Вас есть возможность проводить измерения при длине волны 205 нм?

Вы правильно заметили, что длина волны 205нм очень удобна. Я тоже на ней остановился. В частности, изучив методы Скоупса и Крейша. В статье первого есть также простые уравнения для определения концентрационной (мг/мл) экстинкции. В общем случае, когда не требуется высокая точность определения, этот метод вполне подходит.

[inview]

Этот метод, на самом деле, отлично подходит даже, когда нужна высокая точность и чувствительность. При 205 нм очень хоошо поглощают именно пептидные связи, так что Вы в меньшей степени, чем при использовании красителей, зависите от аминокислотного состава белков и пептидов. К тому же Вы получаете прямую пропорциональность между оптической плотностью и числом пептидных связей (т.е. массой пептидного материала). Есть правда два "но"

1. Без кварцевых кювет этот метод Вы использовать не сможете (стекло и пластик в этой области поглощают настолько сильно, что чувствительность метода снижается многократно) + ну, плюс, еще нужны хорошо очищенные реактивы - вода лучше деионизированная, тип I или, на худой конец, три(би)дистиллят. Буферы не все подойдут, некоторые отлично поглощают там же
2. Белки (даже если их концентрация очень мала) будут мешать очень сильно! Так что разбавление препарата тут не поможет. От белков надо избавляться! Либо их осаждать, либо (что лучше) использовать специальные фильтры.

Про сам метод очень коротко: http://www.nanodrop.com/Library/A205%20 ... Method.pdf

И классика (впрочем, Вы, наверное, ее уже читали) The protein protocols handbook под редакцией Уолкера
http://www.ebookee.com/The-Protein-Prot ... 27324.html

[nikkochem]

Вениамин, извините, я тут немного пропал. Скажите, у Вас есть возможность проводить измерения при длине волны 205 нм?

Вы пожалуй на ошибочном пути, если только белка у вас не десятки граммов на литр. При 205нм может поглощать и буфер и масса других продуктов - вы ведь белок не в дистилляте мерять будете?
Много более надежных методов, по флуоресценции продукта взаимодействия дансилхлорида, флуоресценции продукта взаимодействия гидролизата пептидов с ортофталевым альдегидом...

[inview]

А речь (по поставленной задаче) и не идет о следовых количествах. Пептидный (белковый) материал с концентрацией 0,01 г/л даст оптическую плотность примерно 0,3. О каких десятках грамм на литр Вы здесь говорите? Зато, в отличие от любого метода с дериватизацией, здесь полностью снимается проблема непостоянства поглощения (или излучения) света из-за непостоянства аминокислотного состава. Например, окраска дансилхлорилдом или нингибрином будет давать тем более ложнозавышенные результаты, чем больше пептидный материал будет содержать лизина или аргинина. Вениамин планировал проводить гидролиз различных белков (с разной аминокислотной композицией) -> использование методов специфической дериватизации НА САМОМ ДЕЛЕ не позволит сравнивать концентрацию пептидов, полученных при гидролизе разных белков. Метод измерения A205 этого недостатка лишен.

Я уж не стану говорить о том, насколько любой метод с дериватизацией окажется более трудоемок, дорог и сложен в применении к серийным анализам. Более того, мы ведь с Вами не знаем, есть ли у Вениамина спектрофлюориметр, а вот про наличие UV/VIS-СФ - известно.

Ну, и про буферы - а что помешает добавить тот же буфер в холостую пробу - в той же концентрации, что и в образце? Вот и уберем его фоновый эффект. Если спектрофотометр качественный - даже и в чувствительности при этом практически ничего не потеряем.

[nikkochem]

Уважаемый inview именно с концентрациями 0,01 - 0,10 г/дм3 мне и приходилоть работать лет так 12 назад. Причем пришлось разрабатывать подходящую методику. И простой метод определения фотометрией в районе 200 нм мне очень понравился в теории (теоретически все амидные группы поглощают одинаково). Но мое ожидание увидеть красивый правильной формы пик неоправдался. Но буфер мешает настолько, что полностью поглощает и пика невидно вообще - в этой области поглощают свет масса анионов буфера фосфаты, цитраты, оксалаты, нитраты, нитриты, сульфаты, тиосулфаты, сульфиты, пиросульфаты, гидроксиды(и вся эта радость поглощает в области от 200 до 250 нм). Что прикажете с этим делать? Выделять белок и мерить в дисстиляте? Если бы все было так просто - не появилось бы столько различных способов определения белка.

[Осипов Веніамін]

Но буфер мешает настолько, что полностью поглощает и пика невидно вообще - в этой области поглощают свет масса анионов буфера фосфаты, цитраты, оксалаты, нитраты, нитриты, сульфаты, тиосулфаты, сульфиты, пиросульфаты, гидроксиды

Да, вы правы, что многие буферные системы обладают сильным поглощением в УФ. Scopes в статье "Measurement of Protein by Spectrophotometry at 205 nm" за 1974г пишет, что они использовали малопоглощающий буфер: 0,1М K2SO4 + 5мМ KH2PO4 + KOH до рН 7. Причем, указывалось, что поглощение этого буфера сравнимо с поглощением воды на этой длине волны.
А какой буфер(ы) использовали вы?

Полагаю, разные методы годятся для разных случаев, часто связанных со спецификой белка: зависимость от ионной силы, рН среды, зависимость от состава буферной системы. Вот, к примеру, метод Брэдфорда обладает высокой чувствительностью и применим больше для кислых или даже сильнокислых сред, и т.д. Ну и понятно, что разные методы возникали на разных этапах развития как химии белка, так и инструментного обеспечения, давая в последствии модификации. Вот для УФ измерений долгое время не было подходящих УФ спектрометров. Плюс этот метод не очень удобен для микропланшетного применения: кварцевые кюветы дороги, хрупки, да и делать микроячейки из кварца накладно.
В нашем случае зависимость от условий среды (рН, состав буфера и пр.) невелика. А вот нюансы, накладываемые условиями применения различных красителей, значительны.
Главное теперь, чтобы, на практике, как вы правильно заметили, фоновое поглощение среды не "съело" наш пик. Или хотя бы, чтоб разность плотностей была достаточна для получения достоверных результатов.
Думаю, что как только у меня появится физическая возможность выполнить задуманное (наличие кварцевых кювет), сообщу о результатах на форуме.
Спасибо за помощь.

[alexander_bk]

Да пойдет все что угодно! Тут все зависит от того, как вам ваша совесть позволить интерпретировать результаты.

[nikkochem]

А какой буфер(ы) использовали вы?

Буферы использовал не я, а все что мне подсовывали для определения общего белка.

Вот, к примеру, метод Брэдфорда обладает высокой чувствительностью и применим больше для кислых или даже сильнокислых сред, и т.д.

Действительно в щелочной среде данный метод дает ложную реакцию. Поэтому я модифицировал метод стал мерить в растворе фосфорной кислоты, добавляя пробу содержащую белок. Проводили и сравнительные анализы на разных белках и расхождения были серьезные и значимые.

[inview]

Уважаемый inview именно с концентрациями 0,01 - 0,10 г/дм3 мне и приходилоть работать лет так 12 назад. Причем пришлось разрабатывать подходящую методику. И простой метод определения фотометрией в районе 200 нм мне очень понравился в теории (теоретически все амидные группы поглощают одинаково). Но мое ожидание увидеть красивый правильной формы пик неоправдался. Но буфер мешает настолько, что полностью поглощает и пика невидно вообще - в этой области поглощают свет масса анионов буфера фосфаты, цитраты, оксалаты, нитраты, нитриты, сульфаты, тиосулфаты, сульфиты, пиросульфаты, гидроксиды(и вся эта радость поглощает в области от 200 до 250 нм). Что прикажете с этим делать? Выделять белок и мерить в дисстиляте? Если бы все было так просто - не появилось бы столько различных способов определения белка.

Работать в трис-HCl, в боратных буферах, в солевых фосфатных до 5 мМ (ни с одним из них никаких проблем не было), да и в трис-фосфатном до 10 мМ тоже всё работало вполне чистенько. Машины: Thermo Scientific Helios Alpha или Gamma

[inview]

Вот, к примеру, метод Брэдфорда обладает высокой чувствительностью и применим больше для кислых или даже сильнокислых сред, и т.д.

Действительно в щелочной среде данный метод дает ложную реакцию. Поэтому я модифицировал метод стал мерить в растворе фосфорной кислоты, добавляя пробу содержащую белок. Проводили и сравнительные анализы на разных белках и расхождения были серьезные и значимые.

Не совсем понял: метод Брэдфорд и так использует реактив, содержащий фосфорную кислоту. Если же Вы дополнительно закисляете среду, то от образца к образцу можете создавать неодинаковые условия среду, а при перезакислении чувствительность тереяется так же как и при защелачивании. Про сильные различия в чувствительности метода Брэдфорд к различным белкам (как и для практически всех других колориметрических методов) - так это есть в любом руководстве - в смысле, что давно не новость.

[nikkochem]

Мне несли пробы после щелочного гидролиза, и после добавления реактива (действительно раствор в фосфорной кислоте) раствор оставался щелочным. Зная особенности производства увеличил количество фосфорной кислоты, ну и калибровки конечно новые с учетом нововведения.

[inview]

А, понятно. А не проще было заменить буфер диализом или анионитом, хотя бы в батч-варианте?

[nikkochem]

Так было быстрее, и на поток можно было поставить.