как посадить иминобиотин на агарозу?

[zefir]

Добрый день!!!
Просто жизненно необходимо посадить иминобиотин на агарозу. Дело было так: иминобиотин получен по Хофману, соответственно колонку предполагалось делать по нему же: АН сефароза 4В и 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide
metho-p-tohuenesulfonate. Так вот начальство решило, что это дорого, надо на агарозу , есть дициклогексилкарбодиимид. Вообщем начальство хочет - из того, что есть... А как??? Можен кто делал? Буду очень благодарна...

[Serty]

Не выйдет ДЦК не работает в воде из-за растворимости, а агарозу в органике не растворить. Исходя из вопроса - а что у вас есть?

[Iskander]

ДМФА (он же ДМФ) имеется? ДЦК в нём растворим неплохо. Агарозу вроде тож можно туда запарить

[Iskander]

СТОП!

Вы хотите использовать несшитую агарозу?

[zefir]

Iskander - а я не знаю ... Мне нужна иминобиотиновая колонка почистить на ней стрептавидин. Есть агароза несшитая. Что лучше для моих целей? Видимо что-то все равно нужно будет купить. ДМФА есть Есть сефароза 4В -стаарая. есть соседние лабы, где можно поспрашивать

[Iskander]

Огласите весь список

В смысле - какие промышленные носители у Вас есть. (сефарозы и прочая)
Придумаем что-нить

[avor]

Iskander - а я не знаю ... Мне нужна иминобиотиновая колонка почистить на ней стрептавидин. Есть агароза несшитая. Что лучше для моих целей? Видимо что-то все равно нужно будет купить. ДМФА есть Есть бромциан-активированная сефароза 4В -стаарая. есть соседние лабы, где можно поспрашивать

а знаете стрептавидин отодрать от биотина, так чтобы он потом снова стал стрептавидином - весьма не тривиальная задача.

[zefir]

Да!!! давайте придумаем - сегодня опять в другой лабе работаю, завтра оглашу весь список!!!
По идее иминобиотин должен связывать стрептавидин обратимо

[zefir]

Двухдневный поиск показал наличие только старой CNBr активированной сефарозы бМВ и неактивированной 4В сефарозы. Может можно что то сделать? Программа максимум - задействовать дициклогекислкарбодиимид

[Cycloid]

Имминобиотин, впрочем, как и дестиобиотин обратимо связывают стрептавидин, так что с этим проблем ... не должно быть.
Если Ваша CNBr-активированная агароза фирменная, запакованная и лиофилизированная, то можно попробовать с ней работать. Если она вскрытая или в растворе, можете ее сразу выбросить, если она только не вчера получена и стоит в буфере при pH 4. С этой агарозой все просто: найдите в интернете протокол размачивания этой сефарозы, промойте и налейте в щелочном буфере гексаметилендиамина. При этом у Вас получится аминированная агароза.
Если начинать с немодифицированной агарозы 4В, то ее сначала нужно активировать... Можно BrCN, но лучше не надо - он ядовит похлеще цианидов и летучий. Поищите, может быть у Вас есть дисукцинимидилкарбонат или хлористый цианур. Для активации агарозы, которая обычно замочена в водно-спиртовом растворе, ее нужно сначала отмыть и сменить растворитель на органический (ДМФ). Для этого моете агарозу сначала водой, затем 25%ДМФ, затем 50%ДМФ, потом 75%ДМФ, только потом моете чистым ДМФ, в нем же проводите активацию. Дисукцинимидилкарбонатом или цианурхлоридом в присутствии ДМАПа или триэтиламина соответственно, агароза активируется, после чего промывается ДМФ и поверху наливается гексаметилендиамин. Опять же получается аминомодифицированная агароза. На нее уже можно вешать Ваш иминобиотин. В том же ДМФе суспендируете амино-агарозу, растворяете там иминобиотин и добавляете ДЦК. Можно ДМАПа для активации забросить. После реакции хорошо и долго отмываете чистым ДМФом, а потом меняете растворитель на воду ступенчатым градиентом: 25% воды, 50% воды, 75% воды, 100% воды. Промываете водой и чистите стрептавидин!