LC-MS и с чем его едят.

[Deminolog]

Итак, в курилке началось активное обсуждение, что же из LC-MS можно выжать-то? Какую информацию, для чего используем?
Естественно, предлагаю сразу конкретизировать: MS или MS/MS, ионизация, объект, какой прибор стоит (хотя бы тип масс-анализатора). Итак, поехали
Лично мне тоже непонятно, что можно разнести на 24 страницы... Иль у тут речь идет о полимерщине, протеомике?

[Любитель_Манниха]

Не, ну если стопиццот пиков и каждый расписывать

[Deminolog]

Да не, просто допустим, одна страница на ушла на то, чтобы описать систему, условия съемки. Вторая страница - хроматограмма. Если это органики - то основной продукт и пара-тройка побочных, соответственно приложить масс-спектр каждого. Если MS/MS - то следом же еще хотя бы предположить фрагментацию.
Ну и если есть аддукты - то и их объяснить надо в любом случае. Иначе никак. Но больше - не понимаю... Ну 4 странички где-то получится, по моим подсчетам... Если MS. Тандемники чуть больше

[Serty]

... Если это органики - то основной продукт и пара-тройка побочных, соответственно приложить масс-спектр каждого...

Это хорошая реакция. А если продуктов 10-15, а подозрительные по форме пики нашинковать, то как раз десяток другой страниц наберется. Завтра, на работе попробую найти такой опус
Это только на первый взгляд такие грязные реакции кажутся абсурдом - были случаи, когда медхимикам выделяли с выходом в 5% - им немного нужно, только активность глянуть. Но быстро

[Deminolog]

Ну на этот случай есть хроматограф) Растащить хоть немного это месиво (да, не всегда есть возможность, безусловно, но попробовать стоит всегда! Или это халтура будет ) , да и будем смотреть правде в глаза - только LC-MS ведь не делают) Куда логичнее сделать еще GC-MS (EI). Да, бывают термолабильные соединения, в этом случае уже куда сложнее... Прямой ввод как вариант, но для смеси - это абсолютно бесполезная затея. Да и не люблю я вообще прямой ввод в ГХ-МС...
Да и органики ведь зачастую знают, что ищут Это тоже несколько облегчает задачу) Просто не надо превращать хроматографию в порнографию
Я понимаю, что зачастую может получиться какая-то масса адская, но даже эту адскую массу предварительно надо хоть как-то почистить. Иль я не прав?) Просто надо уважать и свой, и чужой труд

[Serty]

Термолабильные ладно, у нас большинство просто не летит вовсе, так что GS-MS используют редко.
Для того и снимают LCMS, что-бы понять стоит ли делить, или сразу в слив. Тоже экономия труда, но именно химика, а не прибора. Я кажестя понял противоречие - вы имеете ввиду LCMS высокого качества. А для таких рутинных анализов задействован один прибор, где все колят в одном градиенте за 3 минуты. Разрешение получается не лучше чем у ТСХ, но можно посмотреть есть ли нужный ион. Соотвественно затраты времени и труда невысоки. Вот колонки летят быстро от всякой гадости. Особенно если учесть, что некоторые химики плохо представляют как это работает, и тащут свои образцы незнамо в чем. Лично наблюдал, оператор подразбавляет образец DMSO, а из виалки джин вылетает - образец принесли не упаривая POCl3

[Deminolog]

Вот здесь, кстати, соглашусь с Вами полностью... У многих вызывает ступор фраза: "выбирайте растворитель аккуратно!", соответственно, не всегда есть понимание необходимости очистки... Хотя колонка колонке рознь... Мне, например Луну жалко будет усадить за короткое время... В этом случае может имеет смысл вообще самому научиться набивать колонки при наличии возможности, либо покупать дешевые колонки...
По поводу чистового и чернового у меня тоже свое мнение, скажем так Я не против контроля хода реакции, более того, я считаю это довольно интересным, необходимым. Но также с хоть какой-нибудь очисткой. Ведь если так подумать - можно запросто контролировать ход реакции, оценивать время протекания, полноту. Только надо чуть-чуть напрячься. Если есть возможность, безусловно...
А вот с вариантом быстрого градиента... Насколько это правильно и хорошо приводить данные по веществу конкретному, не добившись его полного хроматографического разделения? Просто иначе-то масс-спектр не привести) Или обычно просто пишется, что ион такой-то соответствует [M+H], например?
Да и вообще, красивая хроматограмма - это прекрасно))))
А тяжелые... Да, увы, GC-MS тогда возможности особо нет применять... Но LC-MS/MS выручит

Самое убойное, с чем я сталкивался в плане приготовления пробы, это проба для ГХ-МС в воде на колонке ультра 1... Ну это так, к теме о выборе растворителя и удобоваримости пробы для анализа

[Serty]

... Но также с хоть какой-нибудь очисткой. Ведь если так подумать - можно запросто контролировать ход реакции, оценивать время протекания, полноту...А вот с вариантом быстрого градиента... Насколько это правильно и хорошо приводить данные по веществу конкретному, не добившись его полного хроматографического разделения? Просто иначе-то масс-спектр не привести) Или обычно просто пишется, что ион такой-то соответствует [M+H], например? ...

Более того, если слегка почистить, то зачастую адекватнее результаты получаются. Бывает снимут реакционку с 5экв CsF, а потом спрашивают, что это за охрененный пик идет с фронтом и M+ 133
Насчет публикаци - в таком случае можно и поаккуратнее сделать, и градиент подобрать и время увеличить. А в основном рутина - это производство библиотек или контроль реакций. Зачастую формат съемки согласуется с заказчиком. Да и очищенные вещества снимаются поаккуратнее, а для индивидуальных(не библиотечны) помимо LCMS еще и NMR.

[SIG]

У Вас, господа, разные области работы, и поэтому разные взгляды на хроматографию. Я когда покупал в лабу первый в моей жизни ( и в лаборатории) газовый хроматограф, никак не мог объяснить поставщику, что мы не знаем, какие вещества в него будем колоть. Обычно аналитики хотят точно знать, что они определяют, и желательно иметь на это стандартные методы. Синтетику зачастую важно выяснить, есть ли его продукт или кончился ли исходный, а на остальное по большому счету наплевать. В частности, за 5 лет работы с ГХ мы ни разу не пользовались иным методом количественного расчета, как нормализация на 100 %, хотя, очевидно, что для грязных образцов он некорректен.
Для обычного исследовательского института методология, с которой работает уважаемый Serty может оказаться неприемлемой, так как денег на колонки вечно не хватает, и поэтому стараются грязь не колоть ( далеко не всегда, к сожалению). В комбинаторных конторах совершенно другая идеология - доказать, что вещество чистое, или вытянуть их грязной смеси препаративом те самые 5 % активной субстанции. Время, в данном случае, играет главную роль. Стоимость колонок и растворителей в данном случае не играет существенной роли. В том же Хембридже ацетонитрил шел 200 л бочками и несколько приборов работали круглосуточно. Просто для понимания ситуации - когда-то мне предлагала одна контора сделать 100 мг меченного флуоресцентной меткой нуклеотида. Исходное давали, и предлагали за работу $6K. Три стадии синтеза и очистка препаративной ВЭЖХ. Даже если под это дело купить колонку, все равно получалось выгодно. Жаль, что в то время у меня не было ВЭЖХ.
Что касается почистить, а потом нести. У меня двойственное отношение - с одной стороны, конечно, активные примеси вроде неорганических кислот или солей надо убирать. С другой стороны, если Вы заменяете LC-MC на ТСХ, но предварительно будете делать ТФЭ или колоночную хроматографию, исчезает экспрессность, и есть риск потерять интересующие компоненты или изменить их соотношение. Так что нужно искать баланс. К сожалению, зачастую знания синтетиков ( и не только, к сожалению) об основах метода ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС находятся в зачаточном уровне, и им просто не приходит в голову, что образцы нужно как-то очищать. Метод представляется такой волшебной коробочкой - вколол-получил крестик, или минусик на картинке При мне, когда в один биохимический институт купили очень крутой LC-MS ( LC-Q-TOF), на посвященном этому событии заседанию ученого совета всерьез обсуждался вопрос, можно ли колоть туда напрямую мочу мышей, плазму или гомогенизаты тканей. Все были очень расстроены, когда выяснилось, что нет... В общем, мало кто хочет учить матчасть.

[Ptizza]

HPLC/MS 24 стр

[Любитель_Манниха]

А, ну если каждый масс-спектр на пол-страницы давать, да ещё MS/MS

[Deminolog]

Сейчас посидел и подумал немного... Господа, мы забываем еще один очень важный аспект Протеомика Вот где и 24 и 54 страницы быть может
Файлик скачал, сейчас гляну
SIG, если Вы не против, я хотел бы и Вас в дискуссию включить Пара вопросов, если Вы не против: почему использовали нормировку? Была ли возможность сделать градуировку? Поясню свой вопрос: дело в том, что как Вы прекрасно знаете, масс-спектрометры имеют особенность одну - дискриминация по массам. Не думаю, что Вы использовали магнитно-секторный... Таким образом это уже будет один нюанс в погрешность... Другой момент это СКО для хромасса в режиме скан и сим. Дело в том, что количка на хромассе проводится в симе, дабы уменьшить существенно погрешность... Причина проста - скорость сканирования в диапазоне масс или же сканирование по нескольким массам... Сами понимаете... Понимаю, что у органики законы могут быть немного другие, но в аналитике могут (да и должны, как мне кажется) бить за это. Поэтому тут кроме грязи в образце тоже куча нюансов, увы... Так что это просто убыль/получение исходного/продукта мониторится, но количественно... Не хорошо...
Насчет колонок - возможно действительно это просто мое отношение как человека, который не может позволить себе 10 колонок в месяц убивать Да и совесть не позволит
Насчет прямого анализа мочи - это Вы зря думаете, что его нельзя делать Лично видел, делал Точнее есть только одна стадия пробоподготовки - изменяет среду и вызывает денатурацию белка, при этом состав разбавителя практически идентичен составу ПФ, так что еще и хроматографически это верный ход. Метод очень любим криминалистами, кстати говоря. Ведь моча - отличный образец биожидкостей. Куда удобнее остальных. Например, волосы, ногти, кровь, ткани - с ними сложнее уже работать... Но это целая тема для обсуждения, крайне интересная
Безусловно, это не прямой ввод мочи, поскольку это смерть, но все же полнее картинку я даже не знаю как получить. Поскольку реэкстракции могут привести к потере аналита, а это не вариант. Один большой минус - сильно "пачкается" прибор, да и все равно предколонки умирать быстро будут. Но оно того зачастую стоит
Serty, скажите, если спектр MS, а не MS/MS, имеет ли смысл делать библиотеку?) Неужто не бывает соединений с одинаковыми массами у Вас? И, безусловно, я согласен с тем, что какой бы информативный и замечательный масс-спектр не был, надо делать еще другими методами - ЯМР, ИК. Все-таки МС = 50%. Несмотря на то, что его можно посчитать (и то это дело совсем не простое. Даже зная структуру надо уметь складывать паззл с учетом интенсивностей А+1, А+2 элементов, а не только по характеристичным массам). Собственно, это тоже причина по которой стоит немного уделить времени хоть какой-нибудь очистке... Чем чище проба и меньше шум - тем красивее получается результат Но, да, все зависит от задач

[Serty]

Serty, скажите, если спектр MS, а не MS/MS, имеет ли смысл делать библиотеку?
Неужто не бывает соединений с одинаковыми массами у Вас?

Я немного упрощал картину. Быстрый анализ для библиотек делается выборочно, если это не апробирование новой реакции или еще какое-то исследование. Далее идет препаративный LCMS с выделением по заданному MH+. Поскольку в библиотеках заранее известно что должно получится, то выделенное автоматически считается требуемым продуктом, и уже после выделения снимается финальная аналитика, немного более аккуратно чем упомянутая выше. Коечно могут получится изомеры, или просто совпадения, но никто не ждет, что в библиотеке все 100% соединений будут соотвествовать структуре. Разбираться будут уже после обнаружения активности. Все направлено на оптимизацию времени и стоимости.
Другое дело если синтез идет уже для оптимизации найденного лида, там аналитика посерьезнее, ибо нужна полная уверенность в структуре и чистоте.

Глянул, все же у нас 20 страниц похоже редкость - не нашел, но помню бывало Обычно 10-12. Приложил пару - реакционная смесь, и готовый продукт(не из этой смеси). Разница заметна

Ptizza у меня такое впечатление, что у вас проба сильно перегружена.

PS Сам я не работаю на приборе, но смотреть результаты приходится каждый день, и часто помногу

[StYV]

Был такой серийный анализ - количественное определение гомованилиновой кислоты в моче. Очень хорошо шел для диагностики при лечении онкологических больных. Мочу кололи напрямую, примерно 150 анализов и колонке конец.
С уважением StYV.

[Deminolog]

Узнаю отчеты ChemStation... Как же я не люблю эту программу Ужас)))) Неудобный софт (субъективное мнение), хотя приборы у них неплохие
Конечно, для органиков удобно смотреть в процессе, как идет реакция... Параметры удерживания, спектр... В принципе-то этого достаточно при стабильной системе. Тут действительно может сказываться специфика работы, кто к чему привык... Для меня привычно работать уже с конечными продуктами... Единственный момент, когда колется много чернового - оптимизация условий извлечения с поверхности или из матрицы, но куда ж без этого... В синтезах же это заменяется контролем протекания реакций...
Насчет перегрузки пробы - обратите внимание, что приведена относительная интенсивность, а не абсолютная. Концентрации приличные, это да. Но это вопрос к хроматографисту. Он должен был озвучить примерную концентрацию, которую нужно приготовить или же сам приготовить, если было из чего
StYV, да уж, жалко колоночку...

[Serty]

Узнаю отчеты ChemStation... Как же я не люблю эту программу Ужас)))) Неудобный софт (субъективное мнение), хотя приборы у них неплохие...

Да она несколько топорная, впрочем там можно писать макросы - я для своего удобства нарисовал себе новых toolbar-ов

[SIG]

Я не написал, что наш ГХ был без масс-детектора, ПИД+катарометр. Поэтому и процентная нормализация. СКО и прочие вещи никого не волновали, также , как и тот факт , что в пробе половина могла вообще не полететь или не поделится. Стояла одна короткая и широкая (15м*0,53 мм НР-1) колонка, градиент 50-300С и вперед. К сожалению, с масс-спектрометрами я дела непосредственно не имел, работал только с результатами и масс- спектрометристами . У нас везде более простые детекторы -в ГХ - ПИД, на ВЭЖХ DAD, UV или ELSD.
ЧТо касается пресловутого анализа мочи, да я знаю, что можно так делать иногда, но все же желательно осадить белки хотя бы. Обычно все же используют стадию экстракции или ТФЭ. А поскольку все там хотели мерять, в основном, фармакокинетику, прямой ввод мочи неверен и порочен в принципе. Обычно это под сотню или даже больше образцов на один анализ.

[Deminolog]

Пардон, почему-то подумал, что ГХ-МС...
Так а добавьте метанол с муравьиной кислотой 0,1% в мочу, где-то 2:1 Денатурация будет Осадок видно невооруженным взглядом Замечательный, красивый, простой способ, который я себе тоже взял на вооружение, после практики... При этом колонка прожила долго... С учетом того, что я работал месяц, прибор работал нон-стоп, постоянно загружен, УВЭЖХ-система... Анализ заточен на экспрессность... Ну явно за 1000 перевалит количество вколов Так это без предколонки, насколько я помню. Считаю что это хороший результат
Сразу оговорюсь, цель работы была - метаболомика и нативные вещества. Детектирование - MS/MS системы (тройные квадруполи, замечательны на рутине).

[sav]

HPLC/MS 24 стр

Нормальная работа и отчет, не без "косяков", конечно.

Вообще, задача задаче рознь...

[Biginelli]

Ptizza у меня такое впечатление, что у вас проба сильно перегружена.

да, че-то пики фронтЯт по страшному