Помогите с определением аминокислот

[А15]

Подскажите, пожалуйста.
Возникла такая проблема: нужно разделить и определить количественно пролин и гидроксипролин. Как это сделать наилучшим (наименее трудоемким) способом - хроматографически или можно форезом?
Был бы чрезвычайно признателен, если у вас есть ссылки на литературу (а если есть статья конкретно по данной проблеме - буду безмерно благодарен).

[Cherep]

ммм... аминокислотный анализатор? фактически это ионообменная хроматография, АФАИК

[Aryl]

Предколоночная дериватизация? HPLC-UV-FL Дериватизировать можно реагнетами типа FMOC-Cl, Dansyl chloride.Реакция идет колличественно.
Также существуют наборы для определения аминокислот, включающий в себя колонку, реагент, и стандарты, например у Waters.

Код: Выделить всё

http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=ru_RU&cid=1000897

. Ватерс использовал сам. стоит порядка 80 рубликов.
А статьи например вот:

Код: Выделить всё

http://dx.doi.org/10.1016/S0378-4347(01)00162-1

или

Код: Выделить всё

http://dx.doi.org/10.1016/8756-3282(89)90063-X

[Cherep]

Предколоночная дериватизация? HPLC-UV-FL Дериватизировать можно реагнетами типа FMOC-Cl, Dansyl chloride.Реакция идет колличественно.

Про dansyl не скажу, а про Fmoc сильно сомневаюсь. Не знаю, как там у аналитиков, а в синтетической органической химии выделенные выходы Fmoc-аминокислот никогда не 100, АФАИК. И дело вроде бы не в степени конверсии, а в селективности. Полипетиды, например образуются. FmocOSu проблемы решает, но подходит ли это для аналитики - ХЗ. И от щёлочных условий Fmoc беречь надо

[Aryl]

Щелочных это сколько.? Обычно я брал боратный или ацетатный буферные растворы рН 8. Fmoc ом дериватезировали глифосат.

[Cherep]

А, ну буфер - да, тут пожалуй прокатило бы.
А продукты развала Фмок (дибензфульвен, например), не наблюдались?
И всё-таки от образования полипептидов буфер спасать не должен... но раз вы их не видели, не могу вам не верить.

[Aryl]

Кроме избытка фмока и дериватизата выходит еще 2 пика, достаточно интенсивных. В нулевом образце тоже также. Сложно сказать что это.

[ОлегЕ]

В реакции с ДНС-CL образуются ДНС-ОН и ДНС-NH2
может быть и здесь аналогично...

[hongma]

Не мучайте ребенка
Вопрос ведь о простом и доступном без лишних причиндалов методе.
Сам с этим сталкивался - сложности есть )
В общем двумерная бумажная хроматография справилась, хотя и на "3". Сейчас не вспомню условия, а журналы искать после 2-х авральных переездов, честно говоря, в лом. Условия посмотрите хоть в справочнике биохимика - в каких двух системах Rf различаются сильнее.
Навскидку - одна система - спирт/вода с цитратным буфером. Вторая - фенольная. Ацетоновую не использовал-пробовал какую-то, но не пошло сразу, а раз с фенолом получилось, то незачем стало. Задача была чисто прикладная.
Похоже,А15, вы тоже мучаете костную ткань?

[ОлегЕ]

Берется проба 1 мл р-ра экстракта в 50-ном этаноле (2мкмоль/мл), до-бавляют по 0,3 мл 0,1М бикарбонатного буфера (рН 8,3) и по 0,3 мл р-ра дан-силхлорида (1-диметил-амино-5-нафталинсульфохлорида, ДНС-Сl) в ацетоне (конц.2,8мг/мл). Проводится дансилирование в пробирке 1х10 или колбочку с пробкой на шлифе и краном. Пробирку закрывают и оставляют в темноте при комнатной температуре на 1ч., а затем в термостате при 37С на 30 мин. После этого пробирку упаривают досуха под вакуумом. Сухой остаток растворяют в минимальном объеме ацетона (1 : 1). Полученные растворы анализируют мето-дом двумерной ТСХ.
Для разделения ДНС-амк используют двумерную хроматографию при сочета-нии нескольких пар растворителей: А1: ацетон - изопропиловый спирт - 25%-й р-р аммиака (9:7:0,5) двукратно с промежуточным высушиванием 2-3 минуты; В1: хлороформ - бензиловый спирт - этилацетат - ледяная уксусная кислота (6:4:5:0,2) для аминокислот: глицин, лейцин, изолейцин, аланин, фенилаланин, валин, ди-лизин, пролин, o-пролин, ди-орнитин, ди-тирозин, триптофан и в сис-темах А2: ацетон-изопропанол-25 водный аммиак (9:7:0,5) и повторно эти же растворители в соотношении (9:7:2); В2: хлороформ - бензиловый спирт - мета-нол - ледяная уксусная кислота (5:4:1:1) для аминокислот: гистидин, глутами-новая кислот, глутамин, треонин, серин, o-тирозин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, ди-цистеин, аргинин, -лизин. Время хроматографии 20-30 минут.
С фенолом связываться не рекомендую. Ужасная "бяка", и запах и при неосторожном обращении можно ожог получить...
Успехов!

[DSP007]

ТСХ на целлулозной фазе ( ватмане или ТСХ пластинке) с проявлением нингидрином дешевле всего , правда точность - "плюс/минус километр" и экспрессность- анализ за два-три часа. Зато подвижные фазы безвредные, типа бутанол/ацетатный буфер. В принципе можно использовать и ТСХ на силикагеле, он тоже слабый ионнообменник, хотя с водно-спиртовыми буферизованными фазами с силикагелем морока еще та. Посмотрите у Шаршуновой, там были некоторые системы для аминокислот.
По ионнообменной хроматографии и ВЭЖХ посмотрите 1 том Хефтман,Хроматография практическое приложение метода.

Касательно оценки- рулит денситометрия с обычным сканером , программа типа Видеоденситометр, можно скачать шаре-варе версию на сайте краснодарского Сорбполимера (Сорбфил),работает месяц.
Это типа старая информация , но старые методы не всегда плохи.