Хроматография на колонке. Жиры. Флоризил.

[SecretSun]

Здравствуйте, уважаемые коллеги!

У меня возникла необходимость определить содержание хлорорганических пестицидов в подсолнечном масле. Предложенная шефом методика включает в себя стадию очистки на флоризиле (25 г, силикат магния), элюент петролейный эфир: дихлорметан = 4: 1 (300 мл).

Загвоздка состоит в том, что требуется для элюирования 300 мл элюента. Для нас это многовато. Хотелось бы узнать Ваше мнение, можно ли поступить следующим образом.

Уменьшить количество флоризила до 5 г и, как следствие, необходимый объем для элюирования до 60 мл? По идее жир остается на старте, а искомые пестициды переходят в раствор.

P.S.
Возможности для ТСХ-тестирования нет.

Заранее спасибо!

[SkydiVAR]

Тогда и загрузку масла придётся в 5 раз уменьшить. И количество хлорорганики будет, соответственно, в 5 раз меньше. Сможете достоверно количественно отдетектировать? С разумной погрешностью?

[SecretSun]

Здравствуйте!

Спасибо Вам за ответ! Я только делаю первые шаги в аналитической хроматографии (раньше сталкивался только с препаративной), поэтому многое для меня
вдиковинку.

Эксперимент был проведен, но результаты получились неутешительные. Я был бы Вам признателен, если бы Вы указали на слабые места методики. И где я мог допустить серьезную ошибку.
Эксперимент первый, поэтому планирую его ставить повторно после праздников.

Методика.

0,5-1,0 г жира необходимо растворить в 10 мл петролейного эфира. Пробу количественно перенести в хроматографическую колонну с 25 г
активированного флоризила (25 г, силикат магния). Элюировать 300 мл петролейный эфир: дихлорметан (4:1). Элюат упарить досуха. Растворить
в 1,0 мл н-гексана. Определение методом ГХ с детектором электронного захвата.

Результаты:

Введено 100 нг гексахлорбензола и 100 нг хлорпирифоса. Найдено 16,9590 нг/мл гексахлобензола и 24,3595 нг/мл хлорпирифоса. Я в шоке!!! Я рассчитывал, что степень извлечения составит хотя бы 50-60 %.

Skydivar, жду вашего ответа! Заранее спасибо!

[SkydiVAR]

Skydivar, жду вашего ответа!

Моего - потому, что я тут отписался? "Я, конечно, не шаман, но в бубен дать могу!" В том смысле - что я, конечно, не аналитик, но что-то из курса в памяти ещё осталось.

Первое, что следует сделать - приготовить стандарты с разной концентрацией пестицидов и их смесей. Штуки по три (лучше - по пять) каждого. В том смысле - что каждого из пестицидов от 1 нг/мл до (например) 100 нг/мл с шагом в 1/3/5/10 нг/мл (4 штуки). А так же их смесей во всех комбинациях (ещё 16 штук). Если будет по пять каждого - сотня хроматограмм. Потом отмерять каждый раствор не мене 3 раз (статистика, аднака! лучше 5 или 7 раз. Итого - 300-700 хроматограмм).
Потом построить калибровочные кривые.
И только потом делать анализ. Впрочем - это азы. Полагаю, что это Вам и так известно.

Очень печально, что Вам не доступен ТСХ. В этом случае - собирать в пробирки по 10-20 мл и закалывать каждую пробирку в ГЖХ. Таким образом Вы сможете контролировать, были ли смыты пестициды полностью, или часть ещё осталась сорбирована на флорисиле. Элюентом мыть (по крайней мере - в первых экспериментах) до полного вымывания пестицидов (300 мл может и не хватить! имейте в виду!). Неплохо бы проделать модельные эксперименты с разным содержанием пестицидов и/или разным количеством масла при одинаковом абсолютном содержании пестицидов. По результату - построить кривые выхода каждого из пестицидов из колонки от времени с учётом количества/выхода жира.

После проведения этих модельных экспериментов, Вы, скорее всего, сможете оценить, какая доля каждого из пестицидов элюируется "в стандартных условиях" (25 г/ 300 мл/ 0,5 г) и детектируется именно на Вашем хроматографе/колонке/детекторе.

Впрочем, подождём мнений аналитиков. То, что я здесь написал - исключительно "из соображений банальной эрудиции".

Успехов!

[avor]

Я тоже не аналитик. Но!
Я так понимаю мысль протокола заключается в том, что масло на силикате магния не задерживается а гексахлорбензол и приофос задерживаются и потом смываются элюентом.

В связи с чем вопросы:
1)25г это какой объем 5-10мл?
2)Промывалось ли и каким объемом петролея колонка прежде чем пустить в нее смесь с ДХМ?
3)Наблюдались ли следы масла в упаренном элюате?

Далее гипотеза: Т.к. пирофос значительно полярнее гексахлорбензола, он должен лучше удерживаться на полярной колонке силиката. Однако результаты ваших замеров показывают, что потери больше у гексахлорбензола. Тогда можно заметить, что летучесть гексахлорбензола выше чем пирофоса. На основании чего можно предположить, что основные потери произошли при упаривании 300мл элюата. В связи с чем возникают дополнительные вопросы.

4)Как в какой посуде при какой температуре и каком давлении вы упаривали элюат?
5) как и каким образом вы собирали из 300мл или какой другой посуды 200нг вещества в 1 мл растворителя?

[SecretSun]

Привет,Avor!

Мысль правильная! Ответы: 1 - 25 г это около 40 мл; 2 - промывалась 20 мл петролейного эфира, были получены две фракции; 3 - наблюдали при упаривании большое количество жира в обеих фракциях; 4 - посуда стеклянная, температура 40 С, на дисплее 250 (наверное, Па), в отогнанном растворителе следов пестицидов не обнаружено! 5 - это самое страшное:) собрал не в 1 мл, а в 5 мл. Это катастрофа!

[SecretSun]

После проведения этих модельных экспериментов, Вы, скорее всего, сможете оценить, какая доля каждого из пестицидов элюируется "в стандартных условиях" (25 г/ 300 мл/ 0,5 г) и детектируется именно на Вашем хроматографе/колонке/детекторе.

Успехов!

SkydiVAR, есть маленький нюанс, время получения одной хроматограммы 42,6 минуты!!! В день могу сделать не более 6-7:)

[avor]

40 мл колонку надобно минимум 100 мл промывать, а лучше 200. При условии что петролей не обладает никакой элюирующей силой по отношению к аналитам.
Поэтому не удивительно, что у вас осталось масло на колонке.
В данном случае не так важен материал сосуда, как его форма и объем. Форма должна быть вытянутым конусом, а объем как можно меньше. Это означает что отгон надо вести при постепенном прикапывании порций элюата.

Возможные причины ошибок:
1) унос аналитов в промывку колонки из-за недостаточной сорбции(маловероятная причина). Легко проверить если есть возможность определения аналитов в промывке.
2)потери аналитов при сборе упаренного концентрата(грубо говоря, большая часть аналитов осталась на стенках выпарного сосуда) Тут, кстати, возможна и частичная сорбция на стенках от этого возможно может помочь силиконирование, но не факт.
3) неточное определение из-за интерференции с остатками масла в концентрате.

[hongma]

Skydivar, жду вашего ответа!

Моего - потому, что я тут отписался? "Я, конечно, не шаман, но в бубен дать могу!" В том смысле - что я, конечно, не аналитик, но что-то из курса в памяти ещё осталось.

Первое, что следует сделать - приготовить стандарты с разной концентрацией пестицидов и их смесей. Штуки по три (лучше - по пять) каждого. В том смысле - что каждого из пестицидов от 1 нг/мл до (например) 100 нг/мл с шагом в 1/3/5/10 нг/мл (4 штуки). А так же их смесей во всех комбинациях (ещё 16 штук). Если будет по пять каждого - сотня хроматограмм. Потом отмерять каждый раствор не мене 3 раз (статистика, аднака! лучше 5 или 7 раз. Итого - 300-700 хроматограмм).
Потом построить калибровочные кривые.
И только потом делать анализ. Впрочем - это азы. Полагаю, что это Вам и так известно.

Очень печально, что Вам не доступен ТСХ. В этом случае - собирать в пробирки по 10-20 мл и закалывать каждую пробирку в ГЖХ. Таким образом Вы сможете контролировать, были ли смыты пестициды полностью, или часть ещё осталась сорбирована на флорисиле. Элюентом мыть (по крайней мере - в первых экспериментах) до полного вымывания пестицидов (300 мл может и не хватить! имейте в виду!). Неплохо бы проделать модельные эксперименты с разным содержанием пестицидов и/или разным количеством масла при одинаковом абсолютном содержании пестицидов. По результату - построить кривые выхода каждого из пестицидов из колонки от времени с учётом количества/выхода жира.

После проведения этих модельных экспериментов, Вы, скорее всего, сможете оценить, какая доля каждого из пестицидов элюируется "в стандартных условиях" (25 г/ 300 мл/ 0,5 г) и детектируется именно на Вашем хроматографе/колонке/детекторе.

Впрочем, подождём мнений аналитиков. То, что я здесь написал - исключительно "из соображений банальной эрудиции".

Успехов!

Коллега, не пугайте детей
Для предварительной оценки это все излишне. Сначала надо добиться просто разумного результата (открываемости порядка 50-70% например) а потом уже долго и нудно оптимизировать и проверять метрологию.
Так что подход здравый.
Пока в описании неясно следующее. Вот вы пропустили раствор масла через колонку. Какая скорость пропускания? Прошел раствор, дальше что, просто в колонку с остатками масла льете эфир? Опять же скорость элюирования. Далее, непонятно что и сорбция и последующая элюция проводится одним и тем же эфиром... разумнее сорбцию проводить в одних условиях (когда лучше садится целевое вещество) а десорбцию в других... такое впечатление, что только малая часть пестицидов осела на колонку... Пробуйте так.
1/ уменьшить ВСЕ объемы скажем, в 5 раз (тогда будет 0,2 мл гексана - колете ведь все-равно микролитры)
2/пропустили масло через колонку. сполоснули ее небольшой порцией эфира и затем положите сорбент в экстрактор Сокслета эфирный экстракт упарьте и далее по тексту. Если извлекли ваши 17-24%, все дело в плохой сорбции. Если близко к 70% и более - плохая десорбция.