Капиллярный SDS-PAGE с набором от Beckman

[Kaspiana]

Добрый день! Стоит задача определения молекулярной массы белка методом капиллярного электрофореза. В наличии набор от Бекмана для SDS-MW, куплен осенью, вскрыт на днях.
Образец стандарта готовлю по методике - 10 мкл смеси стандарта, 85 мкл буфера для образцов, 2 мкл внутреннего стандарта и 5 мкл 2-меркаптоэтанола. Все смешивается и нагревается при 100С в течении 3 минут.
На электрофореграмме характерный отрицательный пик выходит раньше, чем в примерах производителя, а затем большой горб (смесь стандартов???), а затем узкий пик (как будто бы вн.стандарта???).
Пробовала и так и сяк. И на промывку грешила, и на стандарт думаю.

Буду благодарна советы!

[avor]

Я не знаком с этой системой. Но знаком с SDS-форезом. Тут возможно два варианта, а в формате вашей ситемы это скорее всего один вариант. Вариант первый - у вас плохо с буферами в системе.(здесь видимо все заранее приготовлено фирмой). Вариант второй - испортился гель в капиляре. В приложении к вашей системе - плохой капиляр, менять надо либо его, либо его содержимое, если такое вообще возможно. Для дополнительной проверки попробуйте нанести просто внутренний стандарт без пробы и если это возможно, то в более высокой концентрации(например, взяв объем пробы не 100, а 50 или даже 25 мкл). Если есть какие то маркерные белки, типа сывороточного альбумина. попробуйте сделать пробу с ним(и), но без стандартов и стандарты с ним(и). Думаю будут такие же неразрешаемые горбы.

Да! А, кстати, вроде там УФ детектор стоит. Очень трудно представить себе детекцию УФ с отрицательными пиками, Только если вы делали какой то бланк по сильно поглощающему раствору(буферу). Прокоментируйте это как-нибудь.

[Kaspiana]

И буферные растворы и гель в капилляре из набора фирмы. Набор только что вскрыт, срок годности еще норм. Картинка от первого вкола, которому предшествовала промывка по методике Бекмана же. Один стандарт вколола - это высокий, узкий пик, похоже.
Что интересно, переделав смесь стандартов, получила нормальную картинку, но на один раз.

[avor]

В любом случае все претензии к фирме, точнее, надо консультироваться с их спецами, и лучше на месте в их присутствии, возможно вы где-то лажаете, но понять это может только специалист и только учинив вам допрос с пристрастием или проведя расследовпние на месте.

[Николай 2]

Здравствуйте! Можно ли самому сделать буфер? "Бекман" использует SDS-MW Gel Buffer - proprietary formulation, pH 8, 0.2% SDS. SDS-MW Sample Buffer - 100 mM Tris-HCl pH 9.0, 1%SDS. Если про sample buffer понятно, то из чего состоит gel buffer?