Определение белка. Биуретовая реакция.

[Ops]

Возник у меня такой вот вопрос.
Собираюсь приловчить спектрофотометр для определения белка( ну а в частности пептинов и аминокислот) в жидкости. Планируеться проведение биуретовой реакции. Так вот вопрос: насколько стабильное во времени мы получаем окрашивание? и если интенсивность меняеться, то через какой промежуток времени будет наиболее точный результат?

P.S. Альтернативы биуретовому методу какие можете предложить?

[Iskander]

Все химические методы определения белка "плывут".

Окраска обычно определяется строго в опрелённый момент времени.
Например, если в калибровке выдерживали ровно 30 минут - то и в анализах делайте то же самое. Желательно с точностью до секунд.
Насчёт промежутка времени - он даже в прописях точно не указывается.
Например при определении по Бредфорт написано - "окраска развивается 15 - 40 минут".

Кроме того - контроль температуры. При другой температуре - другие графики.


----- Альтернативы биуретовому методу какие можете предложить? -----

Лоури, Бредфорт и определение на ультрафиолете

[Ops]

Сама биуретовая реакция протекает мгновенно. Если ошибаюсь поправьте. Если фотометрировать сразу(буквально в 1-ую минуту) то результаты будут ближе всего к истине, т. е. ни заниженные ни завышенные. Так?

[Iskander]

Мгновенно реакции с белками не идут.

Если будете фотометрировать в первую минуту - получите занижение результата.
По прописи анализа - ждать до 30 минут. Обязательно тщательное перемешивание и периодическое встряхивание.

Подробнее почитайте в "Практикуме по Биохимии" Северина или подобных книгах-клонах

Здесь этой книги не найдёте. Поспрашивайте просто в библиотеке (бумажной ) или на МОЛбиоле.

[avor]

Возник у меня такой вот вопрос.
Собираюсь приловчить спектрофотометр для определения белка( ну а в частности пептинов и аминокислот) в жидкости. Планируеться проведение биуретовой реакции. Так вот вопрос: насколько стабильное во времени мы получаем окрашивание? и если интенсивность меняеться, то через какой промежуток времени будет наиболее точный результат?

P.S. Альтернативы биуретовому методу какие можете предложить?

Эхехех вам сюда.

http://molbiol.ru/protocol/17_07.html

И сюда

http://molbiol.ru/protocol/17_18.html

Как приготовить Реагенет Фолина написано в уже упомянутом Практикуме Северина.

--Например, если в калибровке выдерживали ровно 30 минут - то и в анализах делайте то же самое. Желательно с точностью до секунд.

Ну уж это уж очень жестко. Это если вы работаете в кинетических режимах. А так обычно не делают.

--Например при определении по Бредфорт написано - "окраска развивается 15 - 40 минут".

Ну это как раз указан период, когда окраска довольно устойчива, и не меняется. Первые 15 минут она растет незначительно хотя это зависит от качества реагента и концентрации белка, потом выходит на плато, а минут через 40-50 начинает падать, а к утру белок просто коагулирует и выпадает в виде синего осадка.

Для справки: В Брэдфорд используется триарилметановый кислый краситель для шерсти и шелка, его аналог одно время даже производили в СССР под названием кислотный яроко-синий для шелка.

Биуретовый метод один из самых быстрых и стойких как и сходный, но на пару порядков более чувствительный, метод с бицинхоиновой кислотой.

--сама биуретовая реакция протекает мгновенно. Если ошибаюсь поправьте.

нет, лучше выдержать раствор минут 10-15 при комнатной температуре.

В конце концов вы сами может определится когда поглощение раствора выходит на плато, вообще говоря, чем больше концентрация белка тем больше времени это занимает.

Лоури по прописи требует выдержки с реактивом Фолина 40', потом окраска устойчива в течении нескольких часов, если мне не изменяет память.

---собираюсь приловчить спектрофотометр для определения белка( ну а в частности пептинов и аминокислот

стандартным методом для определения аминокислот, точнее первичных аминогрупп, является реакция с нингидрином. В принципе возможно получений гидантоиновых призводных с аминокислотами, тогда можно повисить чувствительность метода.

так же возможно получение флуоресцирующихх производных с аминокислотам. С помощью флуорескамина, дансилхлорида ортофталевого альдегида.