Стандарты для гель-хроматографии нестандартны?

[Аркадий]

Возникла необходимость померять молекулярно-массове распределение гуминовых кислот. Выбрали гель-хроматографический метод. Заказали гель Toyorearl HW-55S и стандарты - декстраны с молекулярными массами от 1000 до 50000 Да и голубой декстран (2 000 000 Да). Размеры колонки 1,5*20 см. Элюент фосфатный буфер 0,028М+0,1М перхлорат натрия+5% мочевины. Скорость потока 2 мл/мин. Гуимновая кислота даёт красивый симметричный пик на 6 минуте. Ацетон выходит на 13 минуте, а голубой декстран на второй. И начинается самое интересное - стандарты с молекулярными массами 1000, 5000, 12000, 25000, 50000 дают КАЖДЫЙ по пять пиков в диапазоне от первой до 10 минуты! Для разных стандартов меняется лишь относительная высота (площадь) пиков! Перепроверили приготовление растворов - ничего не поменялось. В чём может быть проблема? Не хочется верить, что стандарты (100 мг за ~100 баксов) настолько "нестандартны". Помогите решить загадку!

[avor]

В чём может быть проблема? Не хочется верить, что стандарты (100 мг за ~100 баксов) настолько "нестандартны". Помогите решить загадку!

Настораживает что Блю выходит на второй. А у стандартов есть пик на первой. И вообще настораживает что выходит на первой и второй. У вас объем колонки 35 мл, а свободный объем практически никогда не бывает меньше 25 процентов, а это почти 9мл или 4.5 минуты, при вашей скорости. Или у вас объем пробы больше половины колонки типа 5-6 мл. А должен быть 0.5мл и меньше тогда можно говорить о разделении ГПХ.

Проблема может быть в детекции. Вы детектируете не пики полимеров, а что-то другое( про блю декстарн такое предположить конечно трудно)

Проблема может быть в "неспецифическом" взаимодействии с сорбентом, тогда возможно нужно использовать другой состав буфера.

Если вам трудно поверить обратитесь к производителю стандартов за разъяснениями. С подробным описанием происходящего. (вы уже не указали объем пробы и состав пробы в смысле в чем она растворена. И уравновешена ли колонка, как долго и чем промывается колонка перед очередным нанесением и тд.)

[Аркадий]

объём ввода 100 мкл. Детектировали на 210, 220, 254, 260 и 280 нм.
Что касается точных времён выхода - могу ошибаться, так как пробовали разные скорости потока. Но то, что пики стандартов выходят раньше блю декстрана - это точно.

[StYV]

По теории блю выходит в мертвом объеме колонки. Вы хотите сказать что вещества выходят ранее этого? На нобеля тянет... И пять пиков? Чересчур... Систему свою проверьте на другом.
С уважением StYV.

[Аркадий]

Вот именно, что чересчур.. Сами держимся за голову. Первый пик у стандартов выходит раньше чем у блю. второй - точно как блю и дальше ещё три... Синий декстран, наш образец ГК и ацетон дают красивые такие симметричные пики. На чём ещё можно проверить систему?

[StYV]

Полиэтиленгликоли попробуйте да и простые гликоли к ним найти не проблема.
С уважением StYV.