Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

физико-химические методы исследования, методики и другие вопросы аналитической химии
analytical chemistry, analysis and techniques for professionals
Ответить
Mikele
Сообщения: 39
Зарегистрирован: Пт мар 28, 2014 6:23 pm

Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение Mikele » Вт апр 09, 2019 4:53 pm

Всем доброго времени суток.

Надеюсь, не слишком промахнулся с разделом форума. Работаю в фарм. лаборатории; как правило, растворы стандартных образцов готовим в двух параллелях. Соответственно, встаёт вопрос с оценкой близости результатов инжекций СО 1 и СО 2. На прошлом месте работы этот расчёт выполняли в экселе, оценивая RSD между отношениями (средняя площадь по n заколам)/(взятая навеска стандартного образца). Одна формула, вбитая в расчётную форму, что-то вроде:
=СТАНДОТКЛОН(S1/a1;S2/a2)*100/СРЗ(S1/a1;S2/a2)
нормировка не более 2 %, в целом, довольно кошерно.

Там же, где работаю сейчас, ситуация обстоит немного по-другому. Чётких рекомендаций в нормативных документах нет, и близость приготовленных растворов стандартов оценивают по-разному. Чаще всего - делят друг на друга отношения (средняя площадь по n заколам)/(взятая навеска стандартного образца) и выражают в процентах; при этом не оговаривается, бОльшее или мЕньшее значение должно быть в знаменателе, как следствие, в одном и том же случае у разных людей может получиться как 99,хх %, так и 100,yy %. Альтернатива - взять по модулю разницу между полученным значением и сотней. Т.е., если, опять же, брать экселевские формулы, получается, соответственно,
=S1*a2*100 /(a1*S2)
или
=ABS(S1*a2*100 /(a1*S2) - 100)
И нормируется это дело тоже в пределах 98-102% (или не более 2,0 %). Правда, норма передаётся изустно и документально не закреплена.

И вопрос знатокам: какой подход является более правильным? Есть ли какая-то нормативная литература, где это было бы прописано? Мне не сложно, хоть тремя способами посчитаю, если будет нужно, но хотелось бы внести ясность в вопрос. Заранее спасибо откликнувшимся.

Аватара пользователя
Commander L
Сообщения: 2121
Зарегистрирован: Вс ноя 11, 2012 4:00 pm
Контактная информация:

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение Commander L » Ср апр 10, 2019 11:06 pm

Mikele писал(а):
Вт апр 09, 2019 4:53 pm
И вопрос знатокам: какой подход является более правильным?
С математической и метрологической точек зрения - никакой. Смотрите:
Пусть градуировочный график зависимости концентрации от площади пика описывается линейной функцией вида y=b*x+a, где у - концентрация, х - площадь пика, b, a - коэффициенты. Предположим, что прямая выходит из начала координат, т.е. a=0, тогда y=b*x. И Вы находите, таким образом, отклонение коэффициента, если же говорить языком математики, то тангенса угла наклона прямой. Если а=0, то еще интереснее становится искомый Вами параметр. Это все, конечно, можно загнать под определение пересчетного коэффициента, но зачем оценивать его СКО? Фактически Вы пытаетесь не результаты анализа сравнивать, а унифицировать отклики разных детекторов - не вижу смысла в том.
RSD = 2% относится к параметру сходимости результатов единичного анализа и оценивается не так. Смотрите определение параметра "воспроизводимость", "внутрилабораторная воспроизводимость". Фармакопею ОФС "Валидация методик анализа" и ОФС "Обработка данных эксперимента", руководство Юргеля по валидации методик, РМГ 61-2010, семейство ГОСТов 5725. Мат. аппарат лучше и правильнее описан в РМГ и ГОСТах.
Критические значения параметров можете посмотреть в APPENDIX 1 – ORA Validation and Verification Guidance for Human Drug Analytical Methods (3 последние страницы). Здесь есть перевод как раз этих трех страничек.
Alea jacta est.
"О, утраченныи, ветром оплаканныи призрак! Вернись!! Вернись!!" Т.Вулф
"Я боюсь стать таким, как взрослые, которым ничто не интересно, кроме цифр." А. де Сент-Экзюпери

Mikele
Сообщения: 39
Зарегистрирован: Пт мар 28, 2014 6:23 pm

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение Mikele » Сб апр 13, 2019 9:29 am

Пусть градуировочный график зависимости концентрации от площади пика описывается линейной функцией вида y=b*x+a, где у - концентрация, х - площадь пика, b, a - коэффициенты. Предположим, что прямая выходит из начала координат, т.е. a=0, тогда y=b*x. И Вы находите, таким образом, отклонение коэффициента, если же говорить языком математики, то тангенса угла наклона прямой. Если а=0, то еще интереснее становится искомый Вами параметр. Это все, конечно, можно загнать под определение пересчетного коэффициента, но зачем оценивать его СКО? Фактически Вы пытаетесь не результаты анализа сравнивать, а унифицировать отклики разных детекторов - не вижу смысла в том.
Полагаю, Вы не совсем верно поняли мой вопрос (или же я непонятно выразился или ошибся в терминологии). Простите, но при чём тут коэффициенты пересчёта, линейности, какая-то унификация и прочее? Мы говорим не о валидационных тестах, а о банальных, рутинных ежедневных задачах. Один день, один хроматограф, один, естественно, детектор и один анализ, допустим, банальное количественное определение активного компонента в препарате. Я готовлю два раствора стандартного образца (да, каждый раз новые растворы) и хочу исключить ошибки разведения, взятия навески СО и т.п. И вот есть две навески стандартного образца (a1, a2), есть усреднённые площади пиков на хроматограммах их растворов (соответственно, S1, S2). Они получены в описанных выше условиях: один день, один прибор. А дальше - как писал выше, разные варианты оценки сходимости стандартов.

vmu
Сообщения: 119
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение vmu » Сб апр 13, 2019 2:48 pm

Mikele, ваши критерии сходимости можно переписать в следующем виде:
первый (тот, что по RSD)
100·|x1 — x2|/(xср·√2) ≤ 2
или
100·|x1 — x2|/xср ≤ 2·√2,
второй
100·|x1 — x2|/x2 ≤ 2,
где x1 = S1/a1, x2 = S2/a2, xср = (x1 + x2)/2.
[Да, Commander L, xi по сути является фактором отклика (угловым коэффициентом, тангенсом угла наклона... с точностью до того или иного множителя) для линейной градуировки с нулевым свободным членом; в >99% фарм. анализов именно такая градуировка и подразумевается.]
Видно, что критерии отличаются друг от друга примерно в √2 ≈ 1.4 раза. Второй критерий более жесткий. Если заменить в знаменателе второго критерия x2 на xср, получим почти эквивалентный (т.к. x1 ≈ x2 ≈ xср) третий критерий:
100·|x1 — x2|/xср ≤ 2.

Смысл расчета RSD для двух значений неочевиден, и наглядная интрепретация первого критерия затруднительна. Второй критерий интуитивно более понятен.
Что касается предельного значения, то общей рекомедации нет. Для одних задач 2% могут быть адекватной величиной, для других — слишком мягкой, для третьих (например, для определения примесей, где достаточно меньшей точности) — слишком жесткой (тут, возможно, и 5% будет нормально).

В случае простых анализов (определение основного вещества в субстанции) во втором критерии первый из стандартных растворов можно рассматривать как контрольный образец (СО — по сути та же субстанция), а второй стандартный раствор — собственно как рабочий стандартный раствор. Выполнение критерия означает, что найденное содержание компонента в первой навеске по второй навеске лежит в пределах 98—102% от номинального значения. Тем самым вы удостоверяетесь, что при анализе собственно субстанции вы сильно не промахнетесь.

Но теперь представьте себе анализ субстанции, для которой норма содержания основного вещества составляет 98—102%. Сделали вы два стандартных раствора. Получили по второму критерию сходимость в 101.9% или 98.1%, т.е. в пределах вашей нормы. Далее считаете содержание вещества в субстанции по одному из стандартных растворов и получаете, например, 99%, т.е. в пределах спецификации. При расчете же по другому стандартному раствору вы получите либо 101% (тоже в норме), либо 97%, т.е. уже вне спецификации. Можно ли сказать, что сходимость в 2% для двух стандартных растворов в данном случае приемлема? По какому из стандартных растворов считать и какой окончательный результат выдавать: брак или не брак? Более-менее адекватным решением проблемы выбора будет расчет не по x1 или x2, а по xср, но норма сходимости для стандартных растворов все равно должна быть жестче для этого случая.

Commander L, по поводу APPENDIX 1 – ORA Validation and Verification Guidance for Human Drug Analytical Methods.
Там есть такие фразы:
"Настоящий документ является унифицированным руководством для лабораторий ORA по минимальным требованиям для валидации методик анализа." "Здесь представлены минимальные требования к валидации методик анализа лекарственных средств в лабораториях ORA".

"Правильность. ... Критерии приемлемости: 97,0% -103,0% извлечения для каждого уровня «введено» для АФИ; 95,0% — 105,0% — для готовых лекарственных форм".
Ясное дело, что для субстанции с нормой 98—102% критерий 97.0—103.0% неприменим.

"Прецизионность (сходимость): выполнить 5 повторных введений стандартного раствора аналита при 100% ожидаемой концентрации, если не указано иное. Критерии приемлемости: RSD не более 2,0%, если не указано иное".
Для субстанции с нормой 98—102% (или 99—101%) это RSD в 2.0% только для одних последовательных вводов стандартного раствора (без повторяемости приготовления растворов и т.д.) — слишком мягкая неадекватная норма. В фармакопеях есть несколько более жеские критерии RSD площадей на хроматограммах для субстанций.

Аватара пользователя
Commander L
Сообщения: 2121
Зарегистрирован: Вс ноя 11, 2012 4:00 pm
Контактная информация:

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение Commander L » Сб апр 13, 2019 9:06 pm

Mikele писал(а):
Сб апр 13, 2019 9:29 am
Один день, один хроматограф, один, естественно, детектор и один анализ, допустим, банальное количественное определение активного компонента в препарате.
Вот так и надо было сразу написать :) . Меня с панталыку сбили "параллели" - обычно под ними подразумевают работу на разных приборах.
vmu писал(а):
Сб апр 13, 2019 2:48 pm
Там есть такие фразы:
"Настоящий документ является унифицированным руководством для лабораторий ORA по минимальным требованиям для валидации методик анализа." "Здесь представлены минимальные требования к валидации методик анализа лекарственных средств в лабораториях ORA".
Главное, что значения параметров там есть. Все правильно, а Вы какие значения хотели видеть?
vmu писал(а):
Сб апр 13, 2019 2:48 pm
В фармакопеях есть несколько более жеские критерии RSD площадей на хроматограммах для субстанций.
Можно ссылку на ОФС? Я что-то не припоминаю такого ни в одной фармакопее.
Alea jacta est.
"О, утраченныи, ветром оплаканныи призрак! Вернись!! Вернись!!" Т.Вулф
"Я боюсь стать таким, как взрослые, которым ничто не интересно, кроме цифр." А. де Сент-Экзюпери

vmu
Сообщения: 119
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение vmu » Сб апр 13, 2019 9:46 pm

Commander L писал(а):
Сб апр 13, 2019 9:06 pm
Можно ссылку на ОФС? Я что-то не припоминаю такого ни в одной фармакопее.
ОФС.1.2.1.2.0001.15. Хроматография.

Аватара пользователя
Commander L
Сообщения: 2121
Зарегистрирован: Вс ноя 11, 2012 4:00 pm
Контактная информация:

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение Commander L » Вс апр 14, 2019 12:31 am

vmu писал(а):
Сб апр 13, 2019 9:46 pm
Commander L писал(а):
Сб апр 13, 2019 9:06 pm
Можно ссылку на ОФС? Я что-то не припоминаю такого ни в одной фармакопее.
ОФС.1.2.1.2.0001.15. Хроматография.
Спасибо. Перечитаю.
Alea jacta est.
"О, утраченныи, ветром оплаканныи призрак! Вернись!! Вернись!!" Т.Вулф
"Я боюсь стать таким, как взрослые, которым ничто не интересно, кроме цифр." А. де Сент-Экзюпери

Waters
Сообщения: 2
Зарегистрирован: Ср май 29, 2019 1:10 pm

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение Waters » Ср май 29, 2019 1:20 pm

В свое время мы крест-накрест пересчитывали площади с навесками. Если укладывались в 2%, то хорошо.

Насчет ОФС "Хроматография". Ее более жесткие критерии - это хорошо, конечно, но коэффициент Стьюдента там берется с доверительной вероятностью 90%. В фарме общепринятая - 95%. Пересчитывать?
Кто установил, что для В=1 максимальное СКО = 0,85? Откуда это значение, если макс. СКО - это расчетная величина на основе этого же макс. СКО?

vmu
Сообщения: 119
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение vmu » Ср май 29, 2019 10:58 pm

Waters, формулу из которой в ГФ берутся численные значения предельно допустимого RSD, можно переписать в виде:

Δmax(P = 0.90) = RSDmax·t90 %,n-1/√n = K·B ≈ 0.35·B (или примерно 1/3 от B).

Левая часть выражения - это полуширина доверительного интервала Δmax для среднего значения площади пика, выраженная в процентах от среднего. Интуитивно понятная суть этого выражения: если вы хотите достоверно проверить, соответствует ли содержание основного вещества в субстанции требованию 100 ± B %, то будьте добры, обеспечьте прецизионность аналитичского сигнала (выражаемую его доверительным интервалом), которая будет не хуже, чем некоторое предельное значение (в данном случае ≈ 0.35·B ≈ 1/3 от B).
Почему именно 0.35·B, почему именно 90 % доверительная вероятность - не возьмусь сейчас ответить. По-большому счету, этот предел (не более 0.35·B) тоже не такой уж жесткий, учитывая, что речь идет всего лишь о нескольких последовательных хроматограммах одного и того же стандартного раствора. А ведь есть и другие факторы (та же точность приготовления растворов), вносящие свой вклад в неопределенность результата анализа. Какие там "укладывались в 2%, то хорошо" при B = 1 % или даже 2 %... Такая проверка сходимости приготовления стандартных растворов, конечно, лучше, чем отсутствие всякой проверки, однако ее ограниченность тоже нужно понимать.

Waters
Сообщения: 2
Зарегистрирован: Ср май 29, 2019 1:10 pm

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение Waters » Чт май 30, 2019 9:43 am

Сто лет не была на этом форуме, забыла, как цитировать пофразово... Как получится.
Δmax(P = 0.90) = RSDmax·t90 %,n-1/√n = K·B ≈ 0.35·B (или примерно 1/3 от B)
Это я понимаю. В этой формуле меня смущает коэффициент К, который, по факту, предлагается взять константой. Это с учетом значения " 0,6 / корень из 2" равного 0,85 (по таблице).
С чего вдруг? Откуда эта цифра взялась?
Почему именно 0.35·B, почему именно 90 % доверительная вероятность - не возьмусь сейчас ответить.
Если вы работаете в фарме, то наверняка сталкивались с публикациями сотрудников Фармакопейного центра Украины (Гризодуб, Леонтьев...)
Они все допуски рассчитывают через 0,32*В. Вот откуда там берется эта цифра, мне понятно, но выводила я ее давно, поэтому сейчас тоже не воспроизведу. В любом случае, 0,32 - понятная величина, не берущаяся из ниоткуда.

Дальше про 90%. ОФС - это закон для фармы. Однако, в подавляющем большинстве случаев, работаем все-таки с 95%. Тогда, по хорошему, надо эти допуски пересчитывать с учетом другого значения коэффициента Стьюдента. Но тогда возвращаемся к значению В. Откуда ноги растут? почему именно это значение?
Просто по сути СКОмакс это СКО для В=1%, n=6 умноженное на некий коэффициент.
Тогда СКО макс для СКО для В=1%, n=6 это равно СКО для В=1%, n=6 в квадрате.
Мутно написано :D
Какие там "укладывались в 2%, то хорошо" при B = 1 % или даже 2 %... Такая проверка сходимости приготовления стандартных растворов, конечно, лучше, чем отсутствие всякой проверки, однако ее ограниченность тоже нужно понимать.
Конечно, вы правы. Если мы укладывались в эти 2%, то навески и площади стандарта усреднялись и именно это среднее значение и использовалось в расчетах. Даже осознавая всю ограниченность этих действий, все же это лучше, чем считать по единичным значениям стандарта - об этом коллеги выше писали.

vmu
Сообщения: 119
Зарегистрирован: Ср июн 06, 2012 6:31 pm

Re: Сходимость стандартных образцов (ВЭЖХ)

Сообщение vmu » Чт май 30, 2019 9:00 pm

Waters писал(а):
Чт май 30, 2019 9:43 am
Кто установил, что для В=1 максимальное СКО = 0,85?
Это я понимаю. В этой формуле меня смущает коэффициент К, который, по факту, предлагается взять константой. Это с учетом значения " 0,6 / корень из 2" равного 0,85 (по таблице)
0.6/√2 = 0.424264 ≈ 0.42, и это пределное RSD% для B = 1, а не B = 2. Внимательнее. И учтите, что первична формула, а не таблица. Значения в таблице - результат использования формулы.
То, что K - константа, как раз понятно. Вопрос в величине и происхождении этой константы, в происхождении этих 0.6/√2.
Waters писал(а):
Чт май 30, 2019 9:43 am
Однако, в подавляющем большинстве случаев, работаем все-таки с 95%.
Не стоит обобщать. Для разных статиститеских задач - разные доверительные вероятности. Например, Q-критерий выявления промахов чаще используют с P = 0.90.
Waters писал(а):
Чт май 30, 2019 9:43 am
Просто по сути СКОмакс это СКО для В=1%, n=6 умноженное на некий коэффициент.
Тогда СКО макс для СКО для В=1%, n=6 это равно СКО для В=1%, n=6 в квадрате.
Мутно написано :D
Что в квадрате? RSDmax(n) = RSDmax(6)·(t90%,5/√6)·(√n/t90%,n-1)·B.
Waters писал(а):
Чт май 30, 2019 9:43 am
Если мы укладывались в эти 2%, то навески и площади стандарта усреднялись и именно это среднее значение и использовалось в расчетах.
Полагаю, все-таки усреднялись "S/a" или "a/S", а не "a" и "S". Усреднение - это хорошо. Среднее значение точнее единичных значений.

Ответить

Вернуться в «аналитическая химия / analytical chemistry»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 5 гостей