Связывание 1,8-АНС с альбумином (определение параметров)

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
Demiurg
Сообщения: 141
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Связывание 1,8-АНС с альбумином (определение параметров)

Сообщение Demiurg » Пн апр 09, 2018 1:03 pm

Всем здравствуйте!
Заинтересовался я тут методикой определения характера микроокружения зонда 1,8-АНС (1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты) в центре связывания сывороточного альбумина. Суть методики следующая: флуоресценция 1,8-АНС тем интенсивнее, чем выше неполярность окружения зонда (точнее, чем ниже диэлектрическая проницаемость среды, в которой он находится); при этом наблюдается зависимое от полярности среды смещение максимума флуоресценции в коротковолновую область (при возбуждении на одной и той же длине волны) – чем неполярнее (гидрофобнее) среда, тем более коротковолновым является максимум флуоресценции. 1,8-АНС – гидрофобный анионный флуорофор, в силу чего относительно прочно и специфично связывающийся с неполярными участками молекул (например, с гемовым карманом гемоглобина и гидрофобными центрами связывания сывороточного альбумина). В воде (или говоря шире в средах с высокой полярностью, точнее с высокими значениями диэлектрической проницаемости), 1,8-АНС обладает лишь слабой флуоресценцией, интенсивность которой возрастает тем сильнее, чем неполярнее является среда (точнее, чем ниже становится диэлектрическая проницаемость среды). При этом наблюдается и выше упомянутый сдвиг в коротковолновую область. Собственно, это всё и наблюдается при внесении 1,8-АНС в различные спирты или их смеси (в данной методике используется калибровочная кривая, отражающая зависимость интенсивность флуоресценции от диэлектрической проницаемости среды, в качестве которой используется ряд спиртов). В общем, как заявляется автором, всё это позволяет определить характер микроокружения зонда при его связывании с белками, неполярными участками мембран и т.д. В сыворотке и плазме крови, как установлено, 1,8-АНС связывается, преимущественно, с альбумином. Вот и возникла идейка использовать этот метод в соответствии с заявленными возможностями на плазме крови больных циррозом печени (возможно, что при данной патологии будут наблюдаться изменения в транспортной функции сывороточного альбумина).
Собственно, при изучении предлагаемого метода возникло несколько вопросов, которые я и хотел бы адресовать уважаемой общественности форума. Буду рад любым комментариям и соображениям. Вопросы следующие:
1. на молекуле альбумина (человеческого, бычьего, крысиного, мышиного и прочих) присутствует несколько центров связывания 1,8-АНС), связывающих этот зонд с разным сродством (афинностью).
Что, в таком случае, будет характеризовать флуоресценция зонда, если он связывается на одной молекуле альбумина с несколькими центрами одновременно?
2. как учесть полноту (или не полноту) связывания 1,8-АНС с альбумином при добавлении зонда до определённой конечной концентрации к определённой концентрации альбумина?
В отсутствии альбумина, зонд (условно говоря) флуоресцирует весь сразу (с той или иной интенсивностью, зависящей от полярности среды), что и наблюдается при построении калибровки в спиртах или их смесях. В то же время, при наличии альбумина, зонд может связаться с белком не полностью (условно - не весь). Можно, наверное, брать альбумин в концентрации, многократно превосходящей концентрацию зонда, что гарантированно обеспечить полное связывание. Но я не уверен в правильности такого подхода…
Методика взята из: Х. Биссвангер “Практическая энзимология” (М. Бином, Лаборатория знаний. 2015 г. С.250-255).
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10885
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Связывание 1,8-АНС с альбумином (определение параметров)

Сообщение avor » Пн апр 09, 2018 8:05 pm

1. В приведенном вами же тексте утверждается прямо противоположное, а именно в бычьем сывороточном альбумине только один центр связывания АНС. Если центров несколько. То они должны давать разный сдвиг испускания из-за разной ДП центра связывания, а так же кривые титрования на разных центрах будут иметь разный характер.
2.Прекращение нарастания интенсивности флуоресценции в спектре испускания при добавление АНС к макромолекуле свидетельствует об насыщении центра связывания.

Demiurg
Сообщения: 141
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: Связывание 1,8-АНС с альбумином (определение параметров)

Сообщение Demiurg » Пн апр 09, 2018 10:02 pm

В случае БСА, возможно, и один центр связывания (не буду утверждать обратное). Но "на повестке дня" альбумин плазмы и сыворотки крови человека. А в этом случае (человеческий альбумин) установлено несколько центров связывания (4-5). Соображение 1 весьма интересно, как впрочем и 2, но не вполне понятно. Допустим центр связывания 1 даёт какой-то свой определённый сдвиг максимума флуоресценции, а центр 2 - какой-то свой сдвиг. В итоге ведь будет какой-то общий (результирующий) сдвиг для макромолекулы в целом. Как же в таком случае различить сдвиг для каждого центра в отдельности? Если это, конечно, вообще возможно в случае наличия более одного центра связывания...
Спасибо за соображения!

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 10885
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: Связывание 1,8-АНС с альбумином (определение параметров)

Сообщение avor » Вт апр 10, 2018 12:04 am

У вас должно быть несколько пиков испускания, каждый пик соответствует своему центру связывания. Я не знаю какова величина этого сдвига, но если не велика нужен очень хороший спектрофлюориметр(с хорошим высокоразрешающим монохроматором), а если она довольно значительна, то пики будут хорошо разрешаться.

Demiurg
Сообщения: 141
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: Связывание 1,8-АНС с альбумином (определение параметров)

Сообщение Demiurg » Вт апр 10, 2018 11:08 am

Насчёт наличия у меня очень хорошего спектрофлуориметра - это, к сожалению, вряд-ли. Есть Текановский Infinite M200 (планшетный) и Соларовский (Беларусь) СМ 2203 (кюветный). Последний, вроде бы, достаточно неплохой, но вряд-ли очень хороший. Хотя, надо пробовать, а не ванговать:)
Вот насчёт количества центров связывания 1,8-АНСа конкретно в БСА:
"Determination of binding parameters such as the number of ligands and the respective binding constants require a considerable number of experiments to be performed. These involve accurate determination of either free and/or bound ligand concentration irrespective of the measurement technique applied. Then, an appropriate theoretical model is used to fit the experimental data, and to extract the binding parameters. In this work, the interaction between bovine serum albumin (BSA) and 1-anilino-8-naphthalene sulphonate (ANS) is revisited. Using steady state fluorescence spectroscopy, the binding isotherm of BSA/ANS was obtained applying the Halfman-Nishida approach. The binding parameters, site number, and binding site association constants, were determined from the stoichiometric Adair model and Job's plot. The binding parameters obtained were then correlated to the distance of the respective binding site to the tryptophan residues using the energy transfer technique. This approach, that uses both tryptophans independently from each other, is presented as a tool to help understand the binding mechanism of the albumin fluorescent complex. The results show that ANS molecules bind to BSA in up to five different binding sites. Energy transfer from the tryptophan residues to the BSA/ANS complex shows that the four highest affinity binding sites (>10(4) M(-1)) are located at a reasonably close distance (18-27 A) to at least one of two tryptophan residues, while the lowest affinity binding site (approximately 10(4) M(-1)) is located over 34 A away from the both tryptophans."
J. Fluoresc. 2008 Mar;18(2):519-26.A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: binding properties revisited by using energy transfer. Togashi DM, Ryder AG.
Согласно приводимым данным, центров связывания ну уж точно более одного... Что-то г-н Биссвангер "мутное задвигает".
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 3 гостя