как определить активность фермента lipasa с помощью гидролиза п-нитрофениловых эфиров

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
romanosow
Сообщения: 73
Зарегистрирован: Вт июл 21, 2015 3:37 pm

как определить активность фермента lipasa с помощью гидролиза п-нитрофениловых эфиров

Сообщение romanosow » Вт мар 20, 2018 3:06 pm

Добрый день, раньше с таким не сталкивался и читая литературу немного запутался. Вообщем такая задача есть липаза от sigma, надо сравнить активность фермента в свободном состоянии и в присутствии синтезированных аминов (в растворе с липазой образуют агрегаты). Хочу использовать спетрофотометрический метод для определения активности.
1. Буду смотреть кинетику зависимоти количества п-нитрофенола от времени, а вот потом я не очень понимаю как перейти к активности фермента собственно. может кто пояснит? спасибо!

Demiurg
Сообщения: 138
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: как определить активность фермента lipasa с помощью гидролиза п-нитрофениловых эфиров

Сообщение Demiurg » Чт мар 22, 2018 10:35 am

Активность ферментов (A) при фотометрическом способе детекции (что вы, вероятно, и хотите сделать) можно рассчитать, используя нижеприведённые формулы. Активность выражают в т.н. международных единицах (МЕ) или же в каталах (1 МЕ = 16,67 нанокатала). А формула такие:
1. Объёмная активность:
A = (изменение оптической плотности за единицу времени * V*коэффициент разведения)/(коэффициент молярной экстинкции*длина оптического пути*v),
*-изменение оптической плотности за единицу времени - характеризует скорость накопления (в случае если ферментативная реакция идёт с возрастанием оптической плотности) продуктов реакции или убыли (если оптическая плотность убывает) субстратов реакции за единицу времени (обычно за 1 мин.). Если у Вас есть в распоряжении более-менее современные фотометры (например, что-нибудь вроде планшетных ридеров), то эту величину не составляет никакого труда рассчитать (как правило, софт для приборов предусматривает возможность задать расчёт этой величины автоматически). Если же нет, то нужно будет рассчитывать путём проведения измерений в ручном режиме (измеряется оптическая плотность в момент времени t=0 и через какой-то временной интервал. Допустим через минуту или через 5 мин. (в последнем случае величина изменения оптич. плотности делится на 5). Вообще для расчёта этой величины нужно брать тот участок на кривой ферментативной кинетики, на котором зависимость оптической плотности от времени имеет линейный характер.
*-V - объём реакционной смеси, мЛ - объём реагентов + объём образца, внесённого в тот или иной объём реагента
* -коэффициент разведения - величина, на которую увеличивается объём образца при его внесении в реакционную смесь (допустим 10 мкЛ образца было внесено в 200 мкЛ реагента, отсюда коэффициент разведения будет равен (210/10) 21)
*-коэффициент молярной экстинкции - справочная величина, характерная либо для продукта реакции (при увеличении оптич. плотности), либо для субстрата (при убывании оптической плотности)
*-длина оптического пути, см - обычно равна 1 см (если измерение проводится в кюветах), но может быть и иной (как правило, указывается в параметрах кюветы; но для, допустим, планшетов её нужно рассчитывать, поскольку для каждого объёма реакционной смеси в лунке планшета, длина оптического пути будет своя)
*-v - объём раствора фермента (или тестируемого на ферментативную активность образца), внесённого в реакционную смесь
1. Удельная активность (активность, нормированная на что-то; например, на концентрацию белка):
A = (изменение оптической плотности за единицу времени * V*коэффициент разведения)/(коэффициент молярной экстинкции*длина оптического пути*v*N),
-N - значение величины, на которую нормируется активность (концентрация белка в образце, если активность нормируется на его концентрацию или же концентрация клеток в образце, если измерение проводится в клеточной суспензии)
остальные обозначения те же, что и в случае расчёта объёмной активности.
Попробуйте найти книгу Ханс Биссвангер Практическая энзимология (Москва, Бином. Лаборатория знаний. 2015 г.). В ней хорошо и доступно расписано то, что Вам требуется. Да и в целом информации по интересующему Вас вопросу хватает.

Аватара пользователя
maks
Сообщения: 13631
Зарегистрирован: Вс апр 19, 2009 3:32 pm

Re: как определить активность фермента lipasa с помощью гидролиза п-нитрофениловых эфиров

Сообщение maks » Чт мар 22, 2018 6:06 pm

Если не секрет, Вы хотите дезактивировать липазу таким образом ?
он химик, он ботаник-князь Федор , мой племянник

Dimpler
Сообщения: 171
Зарегистрирован: Вт окт 28, 2003 7:49 pm
Контактная информация:

Re: как определить активность фермента lipasa с помощью гидролиза п-нитрофениловых эфиров

Сообщение Dimpler » Сб апр 28, 2018 10:25 am

romanosow писал(а):
Вт мар 20, 2018 3:06 pm

1. Буду смотреть кинетику зависимоти количества п-нитрофенола от времени, а вот потом я не очень понимаю как перейти к активности
Обычно строят график оптической плотности от времени. Если все пройдет штатно, на графике получите что-то такое:
https://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_ki ... _curve.svg

Тангенс наклона начального участка кривой покажет вам скорость реакции. Этого хватит?

А чтение можно начать с англоязычных статей и вики "Enzyme kinetics", "Enzyme assay". Если этого недостаточно для ваших целей, дальше я бы смотрел учебники для вузов.
Материя бесконечна, но ее все время не хватает кому-то на штаны...

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 1 гость