расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

вопросы современной биологической химии, молекулярной биологии, химической энзимологии и смежных наук
biochem, molbio, chemical enzymology and related discussions for professionals
Ответить
Demiurg
Сообщения: 176
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение Demiurg » Чт июл 27, 2017 11:27 pm

Здравствуйте!
При попытке определить концентрацию полумаксимального ингибирования (IC50) в отношении активности супероксиддисмутазы в цитозольной фракции ткани печени крысы получен вот такой график. Активность определялась по ингибированию супероксиддисмутазой восстановления нитросинего теразолия до формазана в результате окисления адреналина до аденохромов в щелочной среде (рН 9.7.). Бралось 170 мкЛ карбонатного буфера, добавлялось 10 мкЛ раствора нитросинего тетразолия (конечная концентрация 25 мкМ) и 10 мкЛ раствора адреналина (конечная концентрация 57,5 мкМ). В реакционную среду вносилось от 10 до 1 мкл образца (цитозольная фракция), с шагом в 1 мкл. В каждом случае объём реакционной среды доводился до 200 мкл буфером. Ну и записывалась "кинетика" роста оптической плотности. По линейному участку рассчитывался прирост оптической плотности за 1 мин. IC50 была рассчитана как объём образца в мкл (внесённый в реакционную среду), который, собственно, на 50% тормозит прирост оптической плотности за 1 мин. (относительно пробы, которая вообще не содержала образца, только буфер).
У меня "смутное подозрение", что определил я что-то не то, поскольку вид зависимости не слишком похож на классические зависимости (https://en.wikipedia.org/wiki/IC50).
Собственно, просьба к уважаемой общественности "наставить меня на путь истинный".
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11401
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение avor » Пт июл 28, 2017 9:16 am

А можно узнать реакция окисления адреналина/восстановления до формазана происходит самопроизвольно без фермента? Тогда возникает вопрос корректно ли к ней применять модель ферментного катализа Михаелеса-ментен? Что в вашей реакции, является молекулой связывающейся с фермент субстратным комплексом и в какой реакции?

Лабораторка? Какой курс? Судя по объемам на планшетном ридере снимали? (Фармазан, образующийся из NBT, образует как минимум коллоид, как максимум осадок. Осадок в зависимости от своего взмучивания может давать очень разную абсорбцию)

Demiurg
Сообщения: 176
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение Demiurg » Пт июл 28, 2017 10:16 am

Здравствуйте avor!
Не, не лабораторка. Я научный сотрудник биохим. лабы и пробую эту методику освоить (чтобы использовать для определения активности СОД). Да, точно планшетный ридер (использую 96-луночные плашки).
Принцип метода (изложенного в статье) примерно такой: адреналин ( в щелочной среде, и чем щелочнее она, тем бодрее идет процесс) САМОПРОИЗВОЛЬНО окисляется (через ряд промежуточных продуктов) до аденохромов (они сами поглощают на 340-350 нм, это используется в некоторых методиках определения активности СОД). При этом образуются супероксид-радикалы, которые окисляют бесцветный нитросиний тетразолий до окрашенного (пик на 560 нм) формазана. СОД, понятное дело, "утилизирует" эти радикалы и, тем самым, ингибирует окисление тетразолия. По степени (в %) ингибирования, в сравнении с контрольной пробой (которая вообще не содержит биоматериала (т.е. СОД), и у которой степень ингибирования 0%) судят об активности фермента.
Чем меньше СОД в реакционной смеси, тем меньше % ингибирования (ну или тем больше прирост оптич. плотности в единицу времени), поскольку чем меньше объём вносимого образца, тем меньше СОД вносится в реакционную смесь... Это вроде как у меня воспроизвелось.
Формазан - да, выпадает из раствора. Но где-то минуте на 10-15-й реакции (от момента начала записи кинетики оптич. плотности, т.е. от момента внесения в реакционную смесь всех компонентов; как все компоненты внесены в лунки, так я и ставлю плашку в ридер и записываю кинетику). Быстрее всего формазан выпадет из контрольной пробы (без СОД), медленнее всего -из пробы, содержащей большего всего СОД (10 мкл цитозольной фракции). Ну, это и понятно (где быстрее больше его образуется, там и быстрее выпадает). Но первые минут 10-15 записи - это ещё светопоглощение растворённого формазана, а не светорассеяние его гранул, выпавших из раствора.
А вот подчиняется ли СОД кинетике МИхаэлиса-Ментен? - я и не знаю. К своему стыду((

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11401
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение avor » Сб июл 29, 2017 2:27 pm

Стоп! Стоп! Каша какая-то.
NBT переходит в фармазан при ВОССТАНОВЛЕНИИ!!!, а не при окислении.

Представить, что супероксид восстановит NBT в фармазан, а сам перейдет в кислород при этом, мне достаточно сложно.
А вот представить что адреналин восстанавливает NBT до фармазана, образуя при этом хиноподобные структуры в ароматическом ядре, можно ,вот только супероксид при этом идет лесом, он тут не участвует.

Я могу предположить, что при окислении адреналина идет конкуренция между NBT(окислитель, который при восстановлении образует фармазан) и кислородом воздуха. Далее предположим, что скорость окисления кислородом лимитируется временем жизни супероксида, как промежуточного продукта - это очень важное для дальнейших рассуждений - допущение. И в обычных условиях скорость окисления адреналина NBT выше, чем кислородом и баланс конкуренции складывается в пользу образования фармазана. Если в систему добавить СОД, то она ускорит процесс диспропорционирования супероксида и он перестанет быть слабым звеном реакции окисления адреналина кислородом и тогда скорость окисления адреналина кислородом повысится и превысит скорость реакции с NBT, таким образом баланс конкуренции изменится в пользу окисления кислородом и образование фармазана замедлится. Т.е в данном случае СОД выступает не как ингибитор реакции окисления, а как ее катализатор. И соответственно кинетика должна подчинятся модели каталитического окисления. А реакция с NBT фактически работает, как индикаторная реакция. (все выше сказанное есть не более чем предположение и не является реальным описанием изучаемого процесса, так правдоподобные фантазии на заданную тему)

Demiurg
Сообщения: 176
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение Demiurg » Сб июл 29, 2017 10:58 pm

В статье (прицеплена к моему первому посту), из которой взята эта методика, как раз-таки и утверждается, что супероксид-анион восстанавливает NBT до формазана... Мол, чем щелочнее среда, тем активнее адреналин превращается в аденохром с генерацией при этом этого самого аниона... СОД утилизирует анион, что влияет на степень (скорость) восстановления NBT (ну или на скорость образования окрашенного формазана), чем и пользуются для оценки её активности.
В этой статье "факт" восстановления NBT до формазана супероксид-анионом просто утверждается, а не доказывается (какими-либо собственными или же чужими исследованиями или как-то иначе). Есть только ссылка на довольно древнюю статью (Altman F.P. (1976) Progr. Histochem.Cytochem., 9, 1-52), которую я не нашёл. И всё...
Получается, что возникает вопрос непосредственно научно-методической состоятельности данной публикации Т.В. Сироты?
Ну, это опубликовано не более и не менее чем в Биомедицинской химии, а туда и не такое попадает((

Аватара пользователя
Гесс
Сообщения: 11557
Зарегистрирован: Ср фев 15, 2012 11:19 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение Гесс » Сб июл 29, 2017 11:38 pm

Demiurg писал(а):
Сб июл 29, 2017 10:58 pm
В этой статье "факт" восстановления NBT до формазана супероксид-анионом просто утверждается, а не доказывается (какими-либо собственными или же чужими исследованиями или как-то иначе). Есть только ссылка на довольно древнюю статью (Altman F.P. (1976) Progr. Histochem.Cytochem., 9, 1-52), которую я не нашёл.
У Альтмана в 1976 году 5 статей, но в Progress in Histochemistry and Cytochemistry только одна, по реквизитам вроде подходит.
Надо найти дои у них на сайте (ну параллельно еще название и абстракт) а дальше скайхаб.
F.P. Altman -- Tetrazolium Salts and Formazans.pdf
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11401
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение avor » Вс июл 30, 2017 2:35 pm

Действительно! Зря я сомневался в том, что супероксид восстанавливает NBT. Вроде пишут, что восстанавливает. Так что все это выглялит так кислород и адреналин генерят супероксид, который генерит формазан, приходит SOD разрушает супероксид и формазан не образуется. Но и в этом случае у вас нет классического ингибирования. Фактически не производство формазана индикаторная реакция на концентрацию супероксида. И фактически вы измеряете кинетику убыли супероксида.

Demiurg
Сообщения: 176
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение Demiurg » Вс июл 30, 2017 4:02 pm

Хм-м... И что же делать?
Баги в самом предлагаемом Т.В. Сиротой методе или это конкретно я что-то не так сделал?

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11401
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение avor » Вс июл 30, 2017 5:44 pm

Так собственно ничего страшного, вы же активность SOD измеряете, а она будет фактически измеряться как обычная концентрация фермента в любой ферментной реакции только убыль формазана можно считать прибылью продукта SOD в реакции с супероксидом.

Demiurg
Сообщения: 176
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение Demiurg » Пн июл 31, 2017 1:28 pm

Уважаемый avor и все присоединившиеся, большое спасибо за участие в обсуждении темы, но из Вашего последнего поста ничего не понял((
Методика работает, т.е. её можно использовать для оценки активности СОД, или нет?
IC50 я определил правильно или нет?
Если правильно, то почему полученная кривая не похожа на классические кривульки при определении IC50?

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11401
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение avor » Пн июл 31, 2017 4:11 pm

Да, конечно можно. Кривая не похожа на ингибирующую кривую, потому что это не ингибирование катализатора, а просто конкурентная реакция по субстрату (супероксиду).

Demiurg
Сообщения: 176
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение Demiurg » Пн июл 31, 2017 4:41 pm

А тогда вообще имеет ли смысл измерять IC50 (или что там на самом деле измеряется) путём внесения в реакционную среду переменных объёмов тестируемого биоматериала и, тем самым, переменных количеств СОД?
Вот на основе приведённого мною графика IC50 cоставляет 0,08856 (мкл?). Как эту величину можно понять, интерпретировать?

Аватара пользователя
avor
Сообщения: 11401
Зарегистрирован: Пн янв 24, 2005 1:13 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение avor » Пн июл 31, 2017 8:09 pm

Demiurg писал(а):
Пн июл 31, 2017 4:41 pm
А тогда вообще имеет ли смысл измерять IC50 (или что там на самом деле измеряется)
Ну там надо посмотреть формулы я сходу не отвечу...

Если у вас нет SOD с известной активностью, то привязать эту величину к чему-то стандартному будет сложно. Но вот относительные активности одного препарата относительно другого можно сравнивать.

Demiurg
Сообщения: 176
Зарегистрирован: Вт мар 09, 2010 3:33 pm

Re: расчёт IC50 (для супероксиддисмутазы)

Сообщение Demiurg » Пн июл 31, 2017 9:32 pm

Ну, у меня есть СОД (не помню, какая точно) в виде сухого порошка с известной активностью (в Ед, на что-то нормированных).

В полулогарифмических координатах вроде как наблюдается больше сходства с классическими ингибирующими кривыми.
Я обсчитывал в программе GraphPad Prism:
http://www.graphpad.com/guides/prism/7/ ... able_2.htm
Такое впечатление, что у кривой область перегиба есть, а вот верхнего и нижнего плато нет. Может, в эти области (малых и больших объёмов образцов, вносимых в реакционную смесь) кривую надо расширить?
У вас нет необходимых прав для просмотра вложений в этом сообщении.

Ответить

Вернуться в «биохимия и молекулярная биология / biochemistry and molecular biology»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 3 гостя