Обработка хроматграммы

[Spoonman]

Здравствуйте!
Помогите, плиз, советом:
Раньше при обработке хроматограмм пик "смотрел" вверх, после возвращения с больничного обнаружил, что коллеги там что-то понажимали, и теперь пик "смотрит" вниз.




Как вернуть все обратно?
Хроматограф shimadzu prominence lc 20

[vmu]

Вы привели хроматограммы одного и того же по составу раствора? На второй хроматограмме масштаб по оси сигнала не виден; можно предположить, что вторая хроматограмма относится к какому-нибудь холостому раствору, с появившимся на ней по той или иной причине отрицательным пиком. А так, ищите в программном обеспечении настройку с названием типа "signal polarity" и меняйте ее знак на противоположный. Детектор-то какой?

[Spoonman]

Спасибо! УФ-детектор.
Вещество одно и тоже. А где искать этот значок? В самой программе или Postrun Analysis?
В самой программе есть этот значок, я его менял на + и на -, при минусу - пик на самой хроматограмме обращен вниз в процессе анализа, при плюсе - обращен вверх, но в обоих случаях, после запуска Postrun Analysis теперь пик хроматограмм смотрит вниз. Вообще, средствами программы можно ли " отзеркалить" хроматограмму.
Прошу прощения за глуповатые вопросы, недавно в теме хроматографии

[vmu]

По вашему софту точно не скажу, но настройка должна быть в основной программе или в каком-нибудь отдельном "configuration server". В Postrun изменить вид хроматограммы, записанной при той или иной полярности сигнала, вряд ли получится. Но обработать хроматограммы с отрицательными пиками при необходимости можно, используя функцию разметки отрицательных пиков.

[Commander L]

В основной программе переключаетесь на расширенный режим настроек (внизу под хроматограммой) - вкладка детектор - меняете параметр Polarity.
В понедельник смогу на картинке показать.
Postrun - обработчик записанных хроматограмм.

[Spoonman]

Спасибо за информацию!

Сегодня прописал ванилин (элюент вода) при 280 нм (оба детектора).
Вот вид интерфейса программы при работе прибора


Вот опять это пик




Потом прописал просто чистый элюент (воду) при 280 нм и опять этот пик.


Причем, в ходе анализа прямая линия



Это что, колонка грязная?

[Гесс]

а три минуты это не мертвый обьем?

[Spoonman]

а три минуты это не мертвый обьем?

А он вообще детектируется? Я просто не знаю, должно ли его быть видно?
Вообще, раньше при тех же условиях (1 мл/мин, 214 нм, элюент вода) прописывал гидромочевину с разными концентрациями, правда, пики торчали вверх на той минуте. Зависимость с концентрациями наблюдалась, так что это не может быть мертвый объем.
Я вот и думаю, может колонку промыть стоит?

[vmu]

Полярность детектирования сейчас нормальная. Отрицательный пик около трех минут - это "системный" пик в районе мертвого времени. (Длина и диаметр колонки и скорость подвижной фазы были бы нелишними, чтобы сказать более уверенно; название колонки и состав ПФ (просто вода???) тоже пригодились бы при выходе обсуждения за рамки первоначального вопроса.) Ничего страшного в этом нет. Подбирайте условия так, чтобы определяемые вещества нормально удерживались (т.е. отделялись от мертвого времени), и будет вам счастье. Хроматограмма ванилина - трэш. Что такое гидромочевина? Гидроксимочевина?

[Spoonman]

Полярность детектирования сейчас нормальная. Отрицательный пик около трех минут - это "системный" пик в районе мертвого времени. (Длина и диаметр колонки и скорость подвижной фазы были бы нелишними, чтобы сказать более уверенно; название колонки и состав ПФ (просто вода???) тоже пригодились бы при выходе обсуждения за рамки первоначального вопроса.) Ничего страшного в этом нет. Подбирайте условия так, чтобы определяемые вещества нормально удерживались (т.е. отделялись от мертвого времени), и будет вам счастье. Хроматограмма ванилина - трэш. Что такое гидромочевина? Гидроксимочевина?

Спасибо!
Колонка с18-300extend agilent
Элюент вода.
Но тогда почему раньше такого пика не было в тех же условиях?

[vmu]

Может, вода несвежая (элюент в банке или та, которую вводите в колонку). Может, колонка грязная. Работая на обращенно-фазовой колонке с подвижной фазой с низкой элюирующей силой, нужно регулярно промывать колонку сильным элюентом. Помойте колонку ацетонитрилом или метанолом.

прописывал гидромочевину с разными концентрациями, правда, пики торчали вверх на той минуте. Зависимость с концентрациями наблюдалась, так что это не может быть мертвый объем.

Может. Само по себе отсутствие удерживания вещества не мешает соблюдению закона Бугера-Ламберта-Бера.

[Spoonman]

vmu
Благодарю вас за ответы. Попробую промыть ацетонитрилом. Да, там гидроксимочевина в тексте была, опечатался ))

[Nickolas]

Попробую промыть ацетонитрилом. Да, там гидроксимочевина в тексте была, опечатался ))

Вам ее не только надо мыть ацетонитрилом, а также иметь ацетонитрил как второй растворитель.
У вас ванилин скорее всего застрял на колонке, если вы используете только воду. Обычно берутся два растворителя ацетонитрил-вода и используется градиентное элюирование. Допустим, начинаем с 5% ацетонитрила, затем в 10 минут 100%. Пару минут задержка на промывание и затем быстро назад к 5-ти% и несколько минут на эквилибрирование. Это все лишь примерно, для маленькой колонки.
То, что вы видите, скорее всего пик растворителя. Он может иметь разные формы и иногда быть отрицательным.
Возможно, наверное, использовать и чистую воду как растворитель(изократическое элюирование), но это специфика для немногих полярных соединений.

[Spoonman]

Nickolas
Спасибо! А вообще какие требования предъявляются к самой воде? Достаточно просто дистиллированной? Вообще сколько ее можно хранить в стеклянной укупоренной колбе? И сколько можно хранить раствор ацетонитрил-вода, соотношением 3:1, например?
Вообще, существует ли какой-то универсальный элюент, подходящий для многих класса соединений? ацетонитрил-вода можно отнести к таковому?
Просто почему для меня лучше работать с чистым ацетонитрилом - при смешении его с водой получается азеотропа, которую разогнать хлопотно

[Nickolas]

Простой дистиллированной воды для ВЭЖХ достаточно. Для UPLC мы покупаем специальную воду, но насколько это оправданно я даже не знаю. Главное иметь фильтры на концах трубок, чтобы избежать частиц. Еще мы добавляем 0,1% трифторуксусной кислоты к воде и ацетонитрилу. Эти растворители вполне нормально хранятся месяцами.
Это довольно универсальная система элюентов. Я работаю с пептидами, иногда с билдинг блоками - все отлично. Лишь недавно один из моих пептидов, содержащий тиазолин, гидролизовался после очистки (из-за низкого pH элюента) и мне впервые пришлось использовать немного другую систему, содержащую буфер+ацетонитрил.
А с чем вы работаете? Не совсем понятно, как можно использовать чистый ацетонитрил.
А вообще литературы по этой теме много. И там можно найти подходящую под ваши нужды систему.

[Commander L]

... *чешет затылок*...
Spoonman, Nickolas
Господа, ну Вы даете!

Spoonman
Ликбез придется проводить...
1). Классика по матчасти - Стыскин, Ициксон, Брауде "Практическая ВЭЖХ" (в сети найдете). Читайте. Есть еще хорошие книги для новичков у Сычева, Лоу "ВЭЖХ. Теоретические основы и решение прикладных задач" и Садека "Как избежать ошибок в ВЭЖХ".
2). При работе на обращенной фазе крайне нежелательно использовать 100% водные или органические элюенты - портите колонку. Происходит растворение и унос привитой фазы в случае органики и пассивация силанольных групп на поверхности силикагеля при 100% воде. Сейчас есть колонки С-18 способные работать при 100% воды. Минимальное количество органики в воде (и наоборот) - 5%. Чистая вода обычно используется в сверхкритической флюидной хроматографии.
3). Стандарт воды для ВЭЖХ - 18 МОм (первый класс чистоты по ASTM). Дистиллят в самом крайнем случае (только если альтернатива ему вода из-под крана). Многое зависит от детектора - Corona CAD или МС требуют максимальной степени очистки воды, иначе видны неорганические примеси. Не забывайте при работе на дистилляте и о том, что Ваш аналит может с какой-нибудь примесью в воде прореагировать, а ионная сила весьма непредсказуемо будет меняться. При работе с дистиллятом и бидистиллятом обязательно контролировать его рН.
4). С какой стати Вас волнует азеотроп воды и ацетонитрила? Если Вы про повторное использование растворителей, то смотрите методы очистки у того же Стыскина.
5). Универсального элюента не существует. В каждом конкретном случае подбирается для конкретной смеси состав подвижной фазы. В ОФХ часто используются элюенты на основе ацетонитрила и воды в разных пропорциях и с разными модификаторами.
6). Про регенерацию колонки, если совет Николаса не поможет, почитайте у Стыскина.

P.S. Учите матчасть - у Вас там капитальный провал.

[StYV]

Привет коллеги!
Вот обрисован правильный подход к делу.
Хотя Стыскина давно уже нет, но хроматографист он был изрядный. После него осталась фирма, там дети сейчас заправляют.
Вообще ВЭЖХ это смесь многих знаний и не только чистой химии.
Учитесь и обрящите.
С уважением StYV.

[vmu]

Учите матчасть

Это правильно, только вам, Commander L, тоже не помешает углубить свои знания, чтобы не выдавать перлы вроде "уноса привитой фазы" органическим растворителем или "пассивации силанольных групп" водой.

[Commander L]

Учите матчасть

Это правильно, только вам, Commander L, тоже не помешает углубить свои знания, чтобы не выдавать перлы вроде "уноса привитой фазы" органическим растворителем или "пассивации силанольных групп" водой.

Знаю, что тут не прав, но "на пальцах" иначе не смог объяснить. Можете доходчиво и сильно не углубляясь объяснить - поправьте.
Матчасть сам тоже периодически подучиваю, некоторые вещи забываются или понимаются со временем.

[Nickolas]

Происходит растворение и унос привитой фазы в случае органики и пассивация силанольных групп на поверхности силикагеля при 100% воде.

То есть при 95%-ах ацетонитрила растворения не происходит, а при 100% то сразу? На аналитических колонках мы используем 100% ацетонитрил при промывании колонки в конце градиента и проблем у нас не возникало. А насчет 100% воды вы правы. Я забыл это упомянуть.